Observación y separación de organelos en vegetales PDF

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Reporte de práctica experimental, con descripción del experimento, resultados y discusión de los mismos....

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LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Reporte No. 3 “Observación y separación de organelos en vegetales”

PROFESOR: PALACIOS RODRÍGUEZ AARÓN

PRESENTAN: De la Torre Navarro Alvaro Gabriel Hernández Aguilera José Uriel Monjaraz Carrillo Nelly Gabriela Pineda Robles Jesús Daniel Ramírez Frausto Brenda Karen Ramos Guerrero Mayte Guadalupe

5 de Octubre 2016

Objetivos ● Realizar distintos procesos de separación de orgánulos vegetales para ser analizados en el microscopio ● Analizar la diferencia estructural entre una célula vegetal y una animal ● Comprender la función específica de los distintos organelos que componen la célula vegetal

Introducción Los vegetales son alimentos procedentes de seres vivos que crecen, pero no mudan de lugar por impulso voluntario. El reino vegetal está compuesto por organismos multicelulares, eucariotas, que son capaces de sintetizar su propio alimento por medio de la fotosíntesis. En su mayor parte se encuentran en hábitats terrestres, pero algunas especies viven en el agua. Sus células se encuentran cubiertas por una pared celular constituidas a base de celulosa, que les da gran rigidez y resistencia. Varían de tamaño desde aquellas pequeñas como los musgos, hasta gigantescos árboles que pueden llegar a medir más de 100 metros de altura. La célula vegetal se puede dividir en cinco secciones para su estudio:

Núcleo. Es el centro mismo de la célula y contiene la información genética. En todas las células de los miembros de una misma especie se halla el mismo número de cromosomas. Membrana nuclear. Recibe otro nombre: envoltura nuclear. Es una delgada capa de lípidos con orificios que consienten el acceso y la salida de material al núcleo de la célula. Membrana plasmática o celular. Es también una capa externa pero en este caso envuelve toda la célula. En su composición predominan los lípidos y las proteínas y su superficie exhibe unos diminutos orificios necesarios para los procesos de intercambio entre la célula y el exterior. Pared celular. Es una capa o estructura rígida compuesta principalmente por celulosa y cuya función es proteger la membrana plasmática. Citoplasma. Es la materia dentro de la membrana plasmática que contiene al citosol y a los orgánulos de la célula. Está revestida por una delgada película. Es todo lo que se encuentra entre la membrana plasmática y el núcleo.

La célula vegetal posee 17 tipos de orgánulos diferentes, que al igual que la célula animal, cada uno cumple con funciones diferentes y específicas: 1. Membrana plasmática: Separa la célula de su entorno; regula el movimiento de sustancias hacia dentro y fuera de la célula. 2. Mitocondria: Oxida combustible para oxidar ATP. 3. Retículo endoplasmático rugoso (RER): En él se encuentran los ribosomas, siendo una diferencia notoria del Retículo endoplasmático liso, cuya función es la síntesis de proteínas. 4. Retículo endoplasmático liso (REL): Síntesis de lípidos; metabolismo de fármacos. 5. Envoltura nuclear: Segrega la cromatina (ADN + Proteína) del citoplasma. 6. Nucleolo: Síntesis de ARN ribosómico. 7. Núcleo: Contiene los genes (la cromatina). 8. Complejo de Golgi: Procesa, empaqueta y distribuye proteínas a otros orgánulos para su exportación. 9. Pared celular: Confiere forma y rigidez; protege a la célula del hinchamiento osmótico. 10. Citoesqueleto: Soporte estructural de las células; facilita el movimiento de los orgánulos. 11. Glioxisoma: Contiene las enzimas del ciclo del glioxilato. 12. Ribosomas: Síntesis de proteínas. 13. Plasmodesmos: Permiten el paso entre dos células vegetales, son unidades continuas de citoplasma que pueden atravesar las paredes celulares 14. Vacuola: Degrada y recicla macromoléculas y almacena metabolitos. 15. Tilacoides:Sintetizan el ATP con aprovechamiento de la energía lumínica. 16. Gránulos de almidón: Almacén temporal de glúcidos, productor de la fotosíntesis. 17. Cloroplasto: Almacena la energía solar, produce ATP y glúcidos. Ya que uno de los principales objetivos de la práctica es la observación de los cloroplastos, haremos hincapié en este organelo.

Estos organelos se encuentran en las células de plantas y algas, poseen una estructura con cierto grado de complejidad, puesto que además de las dos membranas de la envoltura, tienen numerosos sacos internos formados por membrana que encierran el pigmento verde llamado clorofila. Desde el punto de vista de la vida terrestre, los cloroplastos desempeñan una función esencial para el desarrollo y constitución de los seres vivos: En ellos ocurre la fotosíntesis; esta función consiste en utilizar la energía de la luz solar para activar la síntesis de moléculas de carbono pequeñas y ricas en energía, acompañado de liberación de oxígeno. Los cloroplastos producen tanto las moléculas nutritivas como el oxígeno que utilizan las mitocondrias. Los cloroplastos son orgánulos con forma de disco, de entre 4 y 6 micrómetros de diámetro y 10 micrómetros o más de longitud. Aparecen en mayor cantidad en las células de las hojas, lugar en el cual parece que pueden orientarse hacia la luz. Es posible que en una célula haya entre cuarenta y cincuenta cloroplastos, y en cada milímetro cuadrado de la superficie de la hoja hay 500.000 cloroplastos. Cada cloroplasto está recubierto por una membrana doble. El cloroplasto contiene en su interior una sustancia básica denominada estroma, la cual está atravesada por una red compleja de discos conectados entre sí, llamados lamelas. Muchas de las lamelas se encuentran apiladas como si fueran platillos; a estas pilas se les llama grana.

Figura 1. Célula vegetal, estructura y funciones primordiales.

Figura 2. Anatomía del Cloroplasto

Otras estructuras importantes en esta práctica las cuales debemos analizar son los cromoplastos y amiloplastos, comencemos por definir que es un plasto: Los plastos son estructuras claramente diferenciados de forma esférica o elipsoidal, limitados por una doble membrana, almacenan pigmentos, sustancias de reserva o llevan a cabo la fotosíntesis. Los plastos son típicos de las células vegetales.

Figura 14.1. diferenciación de plásmidos cloroplasto->cromoplasto para cambios metabólicos específicos vinculados con la homeostasis vegetal.

Cromoplastos No tienen una forma típica, los hay esferoidales, alargados, lobulados, aciculares, etc. Carecen de una organización interna como los cloroplastos. Su naturaleza química es proteica con exceso de lípidos. Los cromoplastos almacenan pigmentos carotenoides que pueden estar cristalizados o en forma de gránulos. Los pigmentos carotenoides varían del amarillo al púrpura, los hay de dos tipos: carotenoides, pigmentos carotenoides hidrogenados y xantofilas, pigmentos carotenoides oxigenados.

Amiloplastos Se encuentra en los meristemos (Tejidos responsables del crecimiento vegetal), en los tejidos de almacenamiento como cotiledones, endospermo  , tubérculos y células de la caliptra asociadas con el geotropismo. Los amiloplastos pueden formarse directamente a partir de los protoplastos mediante deposición en el estroma o dentro de vesículas derivadas de la membrana interna o por rediferenciación de los cloroplastos.

Estos plastos son capaces de acomular grandes cantidades de almidón, por lo que su función principal radica en el almacenamiento de energía Tanto los cromoplastos como los amiloplastos serán mostrados gráficamente en las siguientes páginas.

Materiales, reactivos y equipo ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

Bisturí Portaobjetos y cubreobjetos Tubos Eppendorf Gotero Gasas Vaso de precipitados 10ml, 100ml Hielo Tubo de centrífuga Pipeta vidrio 5 ml Vortex

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Hoja de lechuga Agua purificada Tomate Patata Lugol Espinaca Solución Tris NaCl Microscopio Balanza Centrifugadora Eppendorf

Método

Resultados Primera sesión Cloroplastos Se observó en el limbo o lámina la concentración total de cloroplastos gracias a su distintivo color verde procedente de la clorofila en su interior, este pigmento se debe a que la clorofila a y b (difieren solo en su composición, misma función), solo absorben las regiones del azul y rojo del espectro electromagnético (el hombre al ser tricromático sólo puede captar variaciones en los radios de anchos de onda primordiales i.e. GBR), reflejando el verde para ser captado por nuestras células oculares i.e. conos y bastones. (Comparar Fig 3 con Fig 4 [blancos positivos] y Fig 5,6 con Fig 11, 12, 13)

Figura 3. Limbo hoja de lechuga cara adaxial.

Figura 4. Corte transversal en nervadura de lechuga.

Lechuga limbo:

Figura 5,6. Muestras obtenidas, limbo de lechuga a 4x y 10x.

Figura 7,8. Muestras obtenidas, limbo de lechuga a 40x y 100x

Figura 9. [Blanco positivo] donde se aprecian claramente los cloroplastos en interior muestra a 100x.

F  igura 10. Las células oclusivas d  e estoma,  el ostíolo cambian su t urgencia p  or ó  smosis, d a  briéndolo o cerrándolo. El agua entra o sale de la célula oclusiva siguiendo la concentración de potasio, que a su vez entra o sale mediante estructuras en la membrana de la célula, con gasto de energía que en conjunto se llama transporte activo .

En la epidermis de lechuga se encontraron pequeños estomas (Fig 7,8); los cuales, marcan una gran importancia en el proceso hidratativo de las plantas y selectividad nutritiva, donde dos células oclusivas i.e. células guarda, se forman en la superficie y delimitan al poro llamado ostiolo, ésta es impermeable al agua y gases debido a una

cutícula que la cubre por el lado interno de la membrana. El funcionamiento de estas reside en su propiedad osmótica donde al llegar al estado turgente el poro deja pasar el agua, inversamente al haber plasmólisis en las células guarda se cierra el poro por orden inmediata de la cutícula.

Lechuga nervadura: En el corte que se obtuvo de la nervadura tipo craspedódroma (venas principales alcanzan el margen laminar) (Fig 11,12 y 13), sólo se pudo observar fibra incolora (polisacáridos no amiláceos), que corresponden a la dureza estructural de tallos; Por lo tanto, no contiene cloroplastos, lo que indica que el limbo es quien se encarga de la fotosíntesis en sus fases clara y oscura, mientras que la nervadura se encarga de dar soporte, comunicar, dar estructura y distribución de agua, sales, metabolitos, ATP, iones etc.

Figura 11 (LN1), 12 (LN2),13 (LN3). Nervaduras de lechuga a 4x,10x y 40x respectivamente, estructura fibrosa compuesta de principalmente almidón, inulina, celulosa y mucílagos.

Cromoplastos Un cromoplasto es el resultado de la diferenciación del plástido conocido como cloroplasto, este proceso con un propósito específico: acumular en invaginaciones de membrana tilacoidal fitonutrientes i.e. (principalmente) anaranjado, caroteno; amarillo, xantofila; rojo, licopeno y verde, clorofila. (Véase Fig 15-19 para determinación sustancia colorante de caroteno y licopeno en tejido tomate.) El cambio es asociado con el (envejecimiento) o maduración del bulbo o botón llamado fruto ya que en él se encuentra una gran cantidad de ROS que no pudo liberar por fotosíntesis (especies reactivas de oxígeno o radicales libres), que la planta trata de expulsar (ya que el oxígeno al ser muy reactivo altera múltiples enlaces en las células). La diferenciación mantiene la homeostasis suprimiendo ciertos genes específicos que mantenían la fotosíntesis y por consiguiente la clorofila y activa otros para la acumulación de carotenoides (en su estructura absorben o cargan electrones que dañan del oxígeno) y conversión a procesadores de azúcares, almidón, lípidos, hormonas y vitaminas. Un dato interesante es acerca de las proteínas de la biosíntesis de almidón las cuales permanecen en cromoplastos de tomate y que aún sigue siendo intrigante. Se sobreentiende que cada lamela se modifica para convertirse en un plasto glóbulo el cual contendrá cualquier fitonutriente.

Use Fig 1. cómo Fig 14.2

Jitomate:

(Arriba) Figura 15 (J1),16 (J2), 17(J3). [Muestras de la práctica] tejido de tomate a 10x, 40x y 100x donde se aprecian el cromoplasto y su abastecimiento de fitonutrientes i.e. caroteno y licopeno.

 orte (Abajo) Fig 18,19. [Blanco positivo] c coronal, t ejido de tomate a 100x (derecha) y 40x (izquierda) con una mayor calidad en la cual se aprecian los tintes amarillo naranja y rojo demostrando el almacenamiento de fito

 e observan nutrientes específicos también s

tanto las paredes cromoplastos.

celulares como los

Amiloplastos o leucoplastos. En la muestra de patata se muestra la presencia de amiloplastos, que son un tipo de plastos que se encarga de almacenar sustancias de reserva, como el almidón, que es en donde se almacena el alimento de las plantas en forma de energía. El almidón está compuesto por dos sustancias en las que la glucosa determina si se trata de amilosa (soluble en agua) o amilopectina. Los amiloplastos se observan como sacos oscuros. La razón por la cual el almidón fue visible al ojo desnudo es gracias a la amilosa; la cual, en presencia de yodo forma un compuesto azul estable a bajas temperaturas. Debido a que el lugol está compuesto por yodo (violeta oscuro disuelto en agua) y yoduro potásico (amarillo disuelto en agua), (Como se observa en las Fig 24,25. Tiñe a los amiloplastos de una coloración violeta-oscuro al café-oscuro) Patata:

Fig 20,21,22,23. [muestra de práctica], se perciben los amiloplastos (también células diferenciadas de los cloroplastos) presentes en las células vegetales.

Figuras 24, 25. [Blanco positivo] muestra de patata teñida con yodo a 100x y 400x. Se pueden observar las membranas de las células y dentro de estas, pequeños sacos violetas, lo que indica la presencia de almidón contenida en amiloplastos.

Segunda sesión Cloroplastos de espinaca Nota: Se consideraron los siguientes cambios en la metodología para comodidad de la práctica: Se recolectaron 1.9g de hoja “limpia” de espinaca (sin venas centrales), y se colocaron dentro de un vaso de precipitados frío, se trituró sin producir espuma y se filtró; todo esto teniendo cuidado de siempre mantener el sistema a temperaturas bajas para lograr preservar las células mientras su manipulación. Al centrifugar, se consideró necesario un tiempo de 3 minutos a 5000 RPM para lograr su correcta separación en las partes más densas; ya que, en un tiempo menor, no se logra el efecto con tanta precisión y poder tomar el sobrenadante, que posteriormente se centrifugó a 10000 RPM por 5 minutos. Igualmente se tuvo especial cuidado en mantener el sistema a baja temperatura. Una vez que se separó el sobrenadante, ahora este se decantó y se desechó para añadir al pellet, 20 μl de solución Tris, al homogeneizar con ayuda del Vortex, y tomar una gota de la suspensión para colocarla en un portaobjetos. Lo que se pudo observar en el microscopio fueron varios cúmulos de cloroplastos, que se encontraban tanto en grupos como dispersos; esto fue posible gracias a la centrifugación, ya que se separaron membranas, núcleos, citoesqueleto, etc, y al volver a centrifugar se separaron los cloroplastos de los demás orgánulos. Se pudieron observar los cloroplastos debido a su color verde, que está dado por la clorofila contenida dentro de ellos.

En esta muestra se observó la tendencia de los cloroplastos a formar pequeños cúmulos (al igual que la mitocondria) o redes en las cuales se fusionan y fisionan esto para mantener residuos como ATP y ROS lejos de otros organelos que puedan ser dañados o necesitan energía.

Fig 26. [Muestra de práctica] donde se aprecia que gracias a la suspensión tris mantiene las características de la célula que esta sigue funcionando y se nota por la fusión de lo cloroplastos (manchas verdes) para mantener estabilidad homeostática.

 igura 27.[Blanco positivo] Muestra de hoja de F  limbo de lechuga 100x donde se puede apreciar c laramente las paredes celulares, así como

l os cloroplastos contenidos en cada una.

Conclusiones Extracción y análisis de cloroplastos, cromoplastos y amiloplastos. Cloroplastos Se concluyó esta primera parte de la práctica donde se hizo un corte coronal muy fino de la muestra de la hoja de lechuga (limbo) y se hizo un segundo corte en la nervadura, los cortes finos se hicieron con el fin de que la laminilla delgada de la lechuga deje pasar a través de ella una mayor cantidad de luz y poder obtener una mejor observación bajo el microscopio, se le agrego una gota de agua y se cubrió la muestra con un cubreobjetos y se observó bajo el microscopio. Se observó unas pequeñas estructuras con forma definida de color transparente que contenía una especie de pila de color verde claro. Concluimos que esa “pila” de color verde son los cloroplastos, orgánulo celular de organismos eucariontes

fotosintetizadores, debido a que en ellos se encuentran los tilacoides, que son los que contienen un pigmento de color característico verde también llamado clorofila. En la segunda muestra de nervadura de la lechuga concluimos que lo que observamos bajo el microscopio fue un conjunto de fibras organizadas linealmente, parece ser que no se encuentran células. Estas venas dan soporte, estructura y forma a las hojas de lechuga, debido a ello, tienen una textura más rígida que la muestra del limbo. Cromoplastos Similar al primer análisis, en este solo tomamos una muestra fina de la pulpa del jitomate maduro evitando el epicarpio. Se colocó la muestra en un portaobjetos y sobre este un cubreobjetos presionando suavemente para que la pulpa del jitomate se extendiera sobre el portaobjetos uniformemente para apreciar una mejor imagen en el microscopio. Bajo el microscopio con los objetivos de 10x y 40x se observaron unas partículas circulares de color rojo, cromoplastos, pudimos identificarlos ya que buscamos blancos positivos y comparando dichas muestras se llegó a la conclusión de que esas partículas rojas son los cromoplastos. Amiloplastos Se llevó una papa a la cual se partió en dos trozos en uno de ellos cortamos con un bisturí una muestra fina de papa para colocarla en un portaobjetos y se dejó secar durante unos minutos para poder agregar lugol, después se le colocó el cubreobjetos para observar lo bajo el microscopio. En los objetivos 4x y 10x se observó un tipo de red color oro con negro, donde se pueden visualizar ligeramente unos puntos oscuros, en el objetivo 40x se observaron unas estructuras con forma definidas más claras que contiene unas partículas de color negro. Debido a que nuestro microscopio carecía de objetivo 100x otro equipo nos proporcionó su fotografía en la cual podemos ver claramente un amiloplasto de color negro y contenido verde por la clorofila. A) Aislamiento de la fracción de cloroplastos Se pesó 1.9 g de hoja de espinaca sin venas donde las colocamos en un recipiente de plástico que estaba sobre una bolsa de congelación para poder así machacar la muestra y mantener a una temperatura de congelación se le añadió 10 mL de solución Tris-NaCl previamente preparado por otro equipo en el laboratorio y 5 mL de agua purificada, se maceró hasta obtener una solución líquida para filtrar a través de varias gasas en un recipiente donde obtuvimos 1.5 mL de muestra para pasarlo a un tubo Eppendorf y centrifugar a 5000 RPM durante 3 minutos, antes de centrifugar llenamos otro tubo con agua con la misma cantidad de líquido que el otro para balancear la centrifugación. Enseguida se tomó la muestra de la centrifugadora y observamos un pellet de color verde, para seguir manteniendo la temperatura de congelación pasamos la muestra a otro tubo de centrífuga con la misma temperatura

inicial, se pasó a decantar el sobrenadante y se centrifugó una segunda vez a 10000 RPM por 5 minutos, se observó el mismo precipitado que se obtuvo en la primera centrifugación al igual se decantó y se descartó el sobrenadante, continuó con la agregación de unas cuantas gotas de Tris-NaCl frío por último col...