Oznaczenie aktywności kwaśnej fosfatazy w homogenacie z kiełków roślinnych PDF

Preview

Summary

Download Oznaczenie aktywności kwaśnej fosfatazy w homogenacie z kiełków roślinnych PDF

Description

Oznaczenie aktywności kwaśnej fosfatazy w homogenacie z kiełków roślinnych 1. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych Enzymy – katalizatory, które zwiększają szybkość reakcji chemicznej, same nie ulegając zmianie. Dzieje się tak, ponieważ enzymy mają zdolność obniżania energii aktywacji cząsteczek. Enzymy nie zużywają się w trakcie przebiegu reakcji. Enzymy nie przesuwają stanu równowagi reakcji, tylko przyspieszają jego osiągnięcie. Energia aktywacji – minimalna energia potrzebna do przebiegu reakcji chemicznej i przeprowadzenia cząstek w stan aktywny, co jest konieczne do wytworzenia lub rozerwania wiązania chemicznego. Miejsce aktywne enzymu – fragment powierzchni enzymu zbudowany z kilku reszt aminokwasowych. Miejsce aktywne bierze udział w wiązaniu substratów i ich swoistym przekształcaniu. W miejscu aktywnym można wyróżnić grupy aminokwasów pełniących różne role w katalizowanym procesie: 



aminokwasy kontaktowe – jeden lub więcej atomów jest oddalony od substratu na odległość odpowiadającą przeciętnej długości wiązania chemicznego; należą do nich aminokwasy wiążące substrat oraz biorące bezpośredni udział w katalizie aminokwasy pomocnicze – które nie stykając się z substratem, pełnią jednak określoną rolę w czynności katalitycznej enzymu, właściwie orientując substrat

W obszarze miejsca aktywnego wyróżnia się miejsce wiązania substratu, czyli miejsce określające specyficzność enzymu oraz miejsce katalityczne, w którym zachodzi katalizowana reakcja. Kompleks enzym – substrat – pierwszy etap katalizy enzymatycznej. Jest to nietrwały związek chemiczny, powstający w wyniku związania substratów przez cząsteczkę enzymu w jej centrum aktywnym. Kompleks ten może rozpaść się na dwa sposoby: może dysocjować do enzymu i substratu ze stałą szybkością k 1 lub może dojść do chemicznej zmiany substratów i uwolnienia produktów ze stałą szybkością k2, przy czym zakłada się, że produkt nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat. Specyficzność substratowa – właściwość enzymów, która polega na tym, że enzym łączy się tylko z konkretnym substratem, do którego dopasowuje się jego centrum aktywne. Określa jaki rodzaj substratu ulega przemianie przy udziale danego enzymu. Zależy od budowy miejsca wiązania.   

model klucza i zamka – enzym i jego substrat są do siebie geometrycznie dopasowane w taki sposób, że idealnie do siebie pasują model indukowanego dopasowania – pod wpływem przyłączenia się substratu, enzym przybiera konformację niezbędną do katalizy model trzypunktowego dołączenia – enzymy reagują tylko z jedną, stereoizometryczną odmianą danego substratu i połączenie enzymu z substratem musi zachodzić co najmniej w 3 miejscach

Podział enzymów ze względu na budowę:  

enzymy proste – zbudowane tylko z aminokwasów enzymy złożone – złożone z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej (kofaktor)

Podział enzymów ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji:      

oksydoreduktazy – przenoszą ładunki (elektrony i jony H3O+) z cząsteczki substratu na cząsteczkę akceptora transferazy – przenoszą daną grupę funkcyjną z cząsteczki jednej substancji na cząsteczkę innej substancji hydrolazy – powodują rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza) oraz rozczepienie wiązań C – C, C – O, C – N liazy – powodują rozpad substratu bez hydrolizy oraz rozszczepienie wiązań (C – C, C – O, C – N) przez eliminację atomu i wytworzenie wiązania podwójnego izomerazy – zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku (geometryczne zmiany w obrębie cząsteczki) ligazy (syntetazy) – powodują syntezę (połączenie) różnych cząsteczek; powstają wiązania chemiczne przy udziale energii z ATP

2. Czynniki wpływające na aktywność enzymatyczną (temperatura, pH, kofaktory, stężenie substratu). Temperatura – szybkość reakcji wzrasta wraz ze wzrostem temperatury, co jest następstwem podwyższenia energii kinetycznej reagujących ze sobą cząsteczek. Optymalna temperatura, przy której szybkość reakcji jest największa to 35 - 40°C. Po przekroczeniu pewnej temperatury (około 60°C) szybkość reakcji będzie spadać, ponieważ enzymy, które są białkowymi cząsteczkami, ulegają denaturacji i zostają zdezaktywowane. pH – większość enzymów ma swoje optymalne pH. Wpływ pH na aktywność enzymów wiąże się z faktem, że enzymy jako białka posiadają wiele aminokwasów ulegających jonizacji, a aminokwasy centrum aktywnego często mogą pełnić swoją rolę tylko w określonym stanie jonizacji. Ponadto na aktywność enzymów, wpływ ma także jonizacja samych substratów oraz kompleksów ES. Optymalne pH dla większości enzymów to 6 – 8. W zbyt niskim i zbyt wysokim pH enzymy mogą ulec denaturacji. Kofaktory – wiele enzymów jest aktywnych tylko wtedy, gdy są związane z niebiałkowymi cząsteczkami pomocniczymi – kofaktorami. Stężenie substratu – początkowo wraz ze wzrostem stężenia substratu szybkość reakcji rośnie, a następnie osiąga stałą wartość. Wynika to z tego, że przy niskich stężeniach nie wszystkie cząsteczki enzymu są wysycone substratem, a więc zwiększenie stężenia substratu spowoduje wzrost szybkości reakcji. Po pewnym czasie wszystkie cząsteczki enzymu będą znajdywały się w kompleksie enzym – substrat i dalsze zwiększanie stężenia substratu nie wpłynie na szybkość reakcji. 3. Pojęcia: kofaktor, koenzym, grupa prostetyczna, holoenzym, apoenzym, izoenzymy, enzymy allosteryczne, jednostka enzymu (U), aktywność właściwa, aktywność molekularna (liczba obrotów). Enzymy to katalizatory, które zwiększają szybkość reakcji chemicznej, same nie ulegając zmianie. Mogą one mieć budowę monomeryczną, posiadając jeden łańcuch polipeptydowy lub oligomeryczną – są zbudowane z dwóch lub więcej podjednostek, będących odrębnymi łańcuchami białkowymi. Ich część białkowa to apoenzym, natomiast część niebiałkowa to kofaktor, który może być jonem metalu lub małą cząsteczką organiczną (koenzymem). Kofaktor – niebiałkowa część enzymu, potrzebna wielu enzymom do katalizowania konkretnych reakcji.  

metale koenzymy: koenzymy/kosubstraty oraz grupy prostetyczne

Koenzym – część niebiałkowa, luźno związana z częścią białkową enzymu. Wiążą się z enzymami tylko na czas reakcji i przenoszą grupy chemiczne pomiędzy poszczególnymi reakcjami. Grupa prostetyczna – część niebiałkowa, trwale związana z częścią białkową enzymu. Związane przez enzym przez cały czas jego istnienia. Holoenzym – katalitycznie aktywny enzym, o złożonej budowie, który poza częścią białkową posiada dodatkowo części nie będące białkami. Holoenzym = kofaktor + apoenzym Apoenzym – katalitycznie nieaktywna, białkowa część enzymu bez kofaktora. Izoenzymy – formy molekularne enzymu oligomerycznego katalizujące tę samą reakcję chemiczną, ale różniące się budową, właściwościami katalitycznymi oraz sposobem regulacji aktywności. Enzymy allosteryczne – grupy enzymów niedziałających zgodnie z kinetyką Michaelisa – Menten’a. Enzymy te składają się z kilku podjednostek i kilku miejsc aktywnych. W przypadku tych enzymów wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu przybiera kształt sigmoidalny. Jednostka enzymu (U) – jednostka aktywności enzymu. Jeden U to ilość enzymu katalizująca przemianę 1 µmola substratu w czasie 1 minuty. Zwykle przyjmuje się określone warunki: temperaturę 30°C, dane pH i maksymalne wysycenie enzymu substratem.

Aktywność właściwa – liczba U przypadająca na 1 mg białka; określa stopień czystości preparatów enzymatycznych. Aktywność molekularna (liczba obrotów enzymu) – liczba cząsteczek substratu, które w danej jednostce czasu mogą zostać przekształcone w produkt przez enzym w pełni wysycony substratem. Odpowiada stałej szybkości reakcji. 4. Kinetyka reakcji enzymatycznej - równanie Michaelisa Menten, wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu. Stała Michaelisa – Mentena – jest to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji V0 osiąga połowę swojej maksymalnej wartości Vmax. KM jest miarą stabilności kompleksu E – S, stanowiąc iloraz sumy szybkości rozkładu E – S, stanowiąc iloraz sumy szybkości rozkładu E – S i szybkości jej powstawania. W przypadku, gdy k1 >> k2 (znacznie większe) to KM staje się również miarą powinowactwa enzymu do substratu:  

wysoka wartość KM wskazuje na słabe wiązanie substratu (gdyż k2 > k1) niska wartość KM wskazuje na silne wiązanie substratu (gdyż k1 > k2)

V0 = Vmax * [S]/KM + [S] = Vmax * [S]/[S] + KM KM = k-1 + k2/k1 jeśli [S] = KM, wtedy V0 = Vmax/2

Wykres zależności szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu.

Fosfatazy (fosfomonoesterazy) są enzymami katalizującymi hydrolityczny rozpad estrów kwasu fosforowego do odpowiedniego alkoholu i kwasu fosforowego. Enzymy te powszechnie występują zarówno w tkankach roślinnych jak i zwierzęcych. Wyróżniamy dwie klasy fosfataz: kwaśne, które wykazują maksymalną aktywność przy pH 4 – 6 oraz zasadowe z maksymalną aktywnością przy pH 8 – 9. Kiełki roślinne są łatwo dostępnym źródłem szeregu enzymów w tym również kwaśnej fosfatazy o małej specyficzności w stosunku do substratu. Rola kwaśnej fosfatazy w roślinie polega na uwalnianiu rezerw fosforanu znajdujących się w kiełkujących ziarnach w postaci m. in. sześciofosforanu inozytolu. Enzym ten jest łatwo uwalniany w trakcie mieszania homogenizowanych kiełków w wodzie. Do oznaczania aktywności enzymu zostanie użyty syntetyczny substrat: nitrofenylofosforan sodu. Reakcja będzie przeprowadzana w warunkach optymalnych dla fosfatazy - w buforze cytrynianowym o pH 5,3. Produktem reakcji katalizowanej przez fosfatazę jest nitrofenol, bezbarwny w pH kwaśnym. Dodanie NaOH zatrzymuje reakcję i umożliwia przekształcenie nitrofenolu w barwny anion nitrofenolanowy.

Ilość produktu reakcji można określić na podstawie pomiaru spektrofotometrycznego. Oznaczanie aktywności fosfatazy prowadzi się przy stałym stężeniu substratu. Ilość enzymu należy dobrać tak, aby stężenie substratu nie ograniczało szybkości katalizowanej reakcji. Zawartość enzymu określa się w jednostkach aktywności, przyjmując za jednostkę taką ilość enzymu, która hydrolizuje 1 µmol nitrofenylofosforanu w ciągu minuty....