Pflanzenphysiologie Praktikum V2 PDF

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WS20/21...

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Kurs Molekularbiologie II / Pflanzenphysiologie 2020/21 Protokollantinnen: Experiment: Enzymologie Datum: 16.02.21 Kursbetreuer:

1. Ziel des Experiments 2. Material und Methoden 3. Ergebnisse Versuchsteil A Tabelle 1: Messwerte des Versuchs zur Reaktionskinetik Zeit t [s]

E578

0

2,445

15

2,02

30

1,835

60

1,475

120

0,66

180

0,5

300

0,42

600

0,305

In Tabelle 1 sind die Werte der Extinktion bei 578 nm, gemessen mit einem Photometer, dargestellt. Als Nullreferenz dient 1 ml destilliertes Wasser.

Abbildung 1: Stärkeabbau gegen die Zeit

Stärkeabbau gegen die Zeit 3 2.5 y = -0.0032x + 1.7295

E578

2 1.5 1 0.5

0 -0.5

0

100

200

300

400

500

600

700

Zeit t in s

In Abbildung 1 ist die Extinktion bei 578 nm gegen die Zeit in Sekunden aufgetragen. Dabei soll der Stärkeabbau dargestellt werden. Ebenfalls wird eine Eichgerade erstellt mit der Formel y = 0,0024x + 0,3032. Die Eichgerade stammt aus dem Graphen der Extinktion ohne Enzym. Die Enzymaktivität soll im Anfangsbereich aus Abbildung 1 mithilfe der Eichgerade bestimmt werden. Die Einheit in der Abbildung ist 1U = 100 μg/min, während die Enzymaktivität in U/mL angegeben wird. Dafür wird für x = 60 der entsprechende y-Wert bestimmt: y = 0,0024 * 60 + 0,3032 = 0,4472. Das heißt, dass nach einer Minute noch 0,4472 μg Stärke vorhanden sind. Es sind 0,0044772 U. Zu Beginn wurden 0,3 ml Enzymlösung mit einer Verdünnung von 1:5 zugegeben. Darum ist das Volumen der Enzymlösung 0,06 ml. Die Enzymaktivität der α-Amylase ist 0,075 U/mL.

Eine Angabe in Katal ist nicht möglich, da die molaren Massen der Stärkemoleküle unterschiedlich sind.

Versuchsteil B Tabelle 2: Messwerte zur Enzymaktivität Probe

Substratkonz. [ug/ml]

E578 mit Enzym

E578 ohne Enzym

1

120

0,001

0,5

2

180

0,001

0,6

3

240

0,068

0,8

4

300

0,1

1,2

5

600

0,3

1,9

6

900

0,55

2,5

7

1200

0,85

3

In Tabelle 2 sind die Substratkonzentrationen der sieben Proben sowie die Extinktionen bei 578 nm einmal ohne und einmal mit Enzym dargestellt.

Abbildung 2: Extinktionswerte gegen die Substratkonzentration 3.5 y = 0.0024x + 0.3032

3

Extinktion

2.5 2 E578 mit Enzym 1.5

E578 ohne Enzym Linear (E578 ohne Enzym)

1 0.5 0

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Substratkonzentration

In Abbildung 2 ist die Extinktion, bei 578 nm gemessen, aufgezeichnet. Einmal wird die Extinktion ohne Enzymbeigabe und einmal mit Enzymbeigabe gemessen. Anhand von Abbildung 2 sollen 10 ΔE-Werte graphisch bestimmt werden.

Tabelle 3: Die Substratkonzentration und ΔE-Werte werden bestimmt, sowie der Kehrwert der ΔEWerte. Substratkonzentration in [ug/ml]

ΔE578

1/ΔE578

120 180 240 300 450 600 900 1000 1200

1/[μg/ml]

0,499

2

0,0083

0,599

1,67

0,0056

0,732

1,4

0,0042

1,1

0,91

0,0033

1,35

0,74

0,0022

1,6

0,625

0,0017

1,95

0,51

0,0011

2

0,5

0,001

2,15 0,47 Die Werte aus Tabelle 3 werden nun zur Erstellung des Michaelis-Menten-Diagramms verwendet.

0,0007

Abbildung 3: Michaelis-Menten-Diagramm

Michaelis-Menten-Diagramm 2.5

2

ΔE578

1.5

1

0.5

0 0

200

400

600

800

1000

1200

Substratkonzentration in [ug/ml]

Abbildung 3 zeigt die Differenz der Extinktionswerte mit und ohne Enzym aufgetragen gegen die Substratkonzentration. Es wurde zum Erstellen neun Werte verwendet. Es zeigt sich der typische Michaelis-Menten-Verlauf.

1400

Um den Km-Wert zu bestimmen wird nun der Kehrwert von ΔE578 und von der Substratkonzentration verwendet und ein Lineweaver-Burk-Diagramm wird erstellt. Abbildung 4: Lineweaver-Burk-Diagramm

Lineweaver-Burk-Diagramm 2.5 y = 220.1x + 0.29

2

1/ΔE578

1.5 1 0.5 0 -0.004

-0.002

0 -0.5

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

1/[μg/ml]

In Abbildung 4 ist das Lineweaver-Burk-Diagramm abgebildet. Daraus lassen sich Km und Vmax ablesen. Der Schnittpunkt mit der y-Achse liegt bei 0,3132, dementsprechend ist vmax = 1/0,3132 = 3,19. Der Schnittpunkt mit der x-Achse liegt bei -0,0014, dementsprechend ist Km = -1/0,0014 = 696,39.

4. Diskussion Die Enzymaktivität der α-Amylase konnte im ersten Versuchsteil bestimmt werden. Dazu wurde die Extinktion bei 578 nm in einem bestimmten Zeitverlauf gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass die Extinktion sinkt, je länger die Probe ruht. Das hängt mit der Enzymaktivität der Amylase zusammen, die die Stärke abbaut. Dadurch werden die eingelagerten Iod-Ionen wieder frei. Die errechnete Enzymaktivität der α-Amylase beträgt: 12,83 U/ml. Im zweiten Versuchsteil wurde die Extinktion bei verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen. Es wurde zwischen Proben mit und ohne zugegebene Enzyme unterschieden. Mit diesen Werten konnte ihre Differenz ermittelt werden und in einem Michaelis-Menten-Diagramm gegen die Substratkonzentration aufgetragen werden. Das Michaelis-Menten-Diagramm zeigt einen hyperbolischen Verlauf. Mithilfe des Michaelis-Menten-Diagramms konnte jeweils der Kehrwert der Differenz der Extinktion und der Kehrwert der Substratkonzentration verwendet werden, um ein Lineweaver-Burk-Diagramm zu erstellen. Aus diesem Diagramm lassen sich die maximale Geschwindigkeit und die MichaelisMenten-Konstante ermitteln. Der Km-Wert entspricht derjenigen Substratkonzentration bei der Vmax/2 erreicht wird. Je höher der Km-Wert ist, desto höher muss die Substratkonzentration sein, damit das Enzym die halbmaximale Geschwindigkeit erreicht. Bei einem hohen Km-Wert ist somit die Affinität zum Substrat niedrig. Unsere Ergebnisse Vmax = 5,93

Km = 1686,34.

Da der Km-Wert sehr hoch ist, lässt sich daraus schließen, dass die Affinität zum Substrat niedrig ist....