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Proyecto final de la materia inmunologia
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Universidad autónoma de Nuevo León. Escuela y preparatoria técnica médica. INMUNOLOGIA GENERAL Docente: LAURA SALAZAR

EVER ALAN DE LA FUENTE SUÁREZ 1915397 16/11/2019

Introducción: Los métodos de precipitación de proteínas mediante el uso de compuestos orgánicos (ej. rivanol, ácido caprílico) o de sales inorgánicas (ej. sulfato de amonio, sulfato de sodio) se han utilizado por más de 60 años para fines de su purificación parcial. Sus principales ventajas sobre otras técnicas más modernas son la simplicidad, el bajo costo, la rapidez, y el alto rendimiento final. La precipitación de proteínas por efecto de sales inorgánicas (salting-out) ha sido investigada en detalle. En general, el aumento de la concentración de iones en el solvente conduce a una mayor interacción proteína-proteína, y la consiguiente disminución en su solubilidad. Cada proteína precipita a una cierta concentración de sales, y las diferencias entre las proteínas son aprovechadas para lograr su separación. Los factores más importantes en este proceso son el pH, la temperatura y la concentración de proteínas.Para las inmunoglobulinas (Igs) se utiliza un pH cercano a su punto isoeléctrico promedio, usualmente entre pH 7,0-8,0. La mayoría de proteínas son menos solubles al aumentar la temperatura (por ejemplo, de 4°C a temperatura ambiente). En cuanto a la concentración de proteínas, cuando esta es baja se requiere mayor concentración salina para la precipitación, y viceversa. Los métodos de precipitación proteica tienen gran utilidad cuando se desea obtener una preparación de inmunoglobulinas parcialmente purificadas, con un mínimo de recursos y un máximo de rendimiento, en forma rápida. Entre estos, los métodos que utilizan sales proporcionan preparaciones enriquecidas en inmunoglobulinas, aunque no logran eliminar por completo la albúmina sérica, así como diversas globulinas del plasma. Por otro lado, la utilización del ácido caprílico (octanoico) es notable, por la relativa pureza con la que se obtienen las inmunoglobulinas, con una contaminación mucho más baja de albúmina, en comparación con el uso de sales.

Fundamento: La inmunoprecipitación (IP) es una técnica que consiste en precipitar el antígeno de la proteína en una solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular. Este proceso se puede utilizar para aislar y concentrar una proteína en particular de una muestra que contiene miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún momento en el procedimiento.

Material: -Sulfato de armonio -agua destilada. -solución diluida de cloruro de amonio o ácido sulfúrico. -suero. -solución salina. -Agitador Magnético. -centrífuga. -salina amortiguada con fosfato de pH 7.2.

Metodología: (Hudson y Hay) 1.Disolver 1000 g de sulfato de amonio (de alta pureza, libre de metales) en 1000 ml de agua destilada, a ~50°C. Dejar a temperatura ambiente durante la noche y ajustar el pH a 7,2 con una solución diluída de cloruro de amonio o de ácido sulfúrico. 2.Diluir la muestra de suero 1:2 con solución salina fisiológica (NaCl 0,15 M). Colocarlo en un recipiente apropiado, sobre un agitador magnético, a velocidad moderada. Evitar la formación de espuma, pues implica la desnaturalización de proteínas. 3.Agregar la cantidad requerida del sulfato de amonio saturado, poco a poco, para llegar a una concentración final de 45% v/v. Por ejemplo, para 10 ml de suero se agregan 8,2 ml de sulfato de amonio 100% saturado. La solución se torna blancuzca, por la formación de un precipitado. Dejar en agitación suave por 15-30 min adicionales, para que los grumos de precipitación crezcan. 4.Centrifugar por 15 min a 1000xg y descartar el sobrenadante. 5.Lavar el precipitado, agregando abundante sulfato de amonio (al 45% de saturación), y resuspendiendo bien los grumos del precipitado. Note que a esta concentración el sulfato de amonio no permite que el precipitado se redisuelva, y funciona solo como un solvente que diluye aquellas proteínas que aún están solubles (principalmente albúmina), atrapadas entre los grumos de precipitado. Centrifugar de nuevo. 6.Descartar el sobrenadante y redisolver el precipitado, al mismo volumen de la muestra original, con solución salina. Centrifugar una vez más, con el fin de eliminar residuos de proteína insoluble (desnaturalizada de modo irreversible). Recoger el sobrenadante. 7.Re-precipitar las inmunoglobulinas, ahora con una concentración final de 40% del sulfato de amonio saturado. Centrifugar. 8.Descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado con sulfato de amonio al 40% de saturación, y centrifugar. Manual de Métodos Inmunológicos 26 9.Descartar el sobrenadante. Redisolver el precipitado en un volumen mínimo de solución salina, o de PBS (salina amortiguada con fosfatos, pH 7,2). 10.Eliminar las sales de la preparación final mediante diálisis contra PBS (ej. 5 cambios de 1 litro en 24 hr), ultrafiltración, o cromatografía de filtración en gel (Sephadex P- 10, G-25, u otros medios similares).

Usos: inmunoprecipitación de cromatina ChIP Secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina ChIP-Seq Inmunoprecipitación de ARN RIP Inmunoprecipitación con entrecruzamiento.

Conclusión (EVER): El imnunoprecipitado es un método en el cual se centra en hacer un precipitado de las proteínas antigénicas, y con esto identificar este mismo y con eso poder atacarlo de una manera mas efectiva, por otro lado es un proceso relativamente fácil, por lo cual puede ser usado fácilmente y poder identificarlo de una manera mas efectiva...