Práctica 03b- Demostración de la acción de la lipasa pancreática y sales biliares PDF

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Facultad de Ciencias médicasEscuela de Medicina HumanaTítulo:◆Práctica 03b- Demostración de la acción de la lipasapancreática y sales biliaresDocente:◆Polo Gamboa, Jaime AbelardoEstudiantes:◆Chavez Carrion, Camila de Jesus◆Ñacari Quispe, Walter Gustavo◆Quipuzco Gutiérrez, Nathaly Elizabeth◆Ramirez R...

Description

Facultad de Ciencias médicas Escuela de Medicina Humana Título: ◆ Práctica 03b- Demostración de la acción de la lipasa pancreática y sales biliares

Docente: ◆ Polo Gamboa, Jaime Abelardo

Estudiantes: ◆ Chavez Carrion, Camila de Jesus ◆ Ñacari Quispe, Walter Gustavo ◆ Quipuzco Gutiérrez, Nathaly Elizabeth ◆ Ramirez Ramos, Randy ◆ Rodrigo Arévalo, Gerard Yoham

Curso: ◆ Bioquímica y biología molecular

Trujillo-Perú 2022-0

Demostración de la acción de la Lipasa Pancreática y Sales biliares I.

Introducción:

Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. Las lipasas sublingual y gástrica actúan sobre los triglicéridos liberando los ácidos grasos, que si son de cadena corta o media son directamente absorbidos. Las contracciones gástricas contribuyen al fraccionamiento mecánico de las partículas grasas. La principal digestión ocurre en el duodeno y yeyuno por acción de la lipasa pancreática, en la interfase agua-lípido y su velocidad depende de la superficie de la interfase, la cual es muy incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de las sales biliares. La lipasa pancreática cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en las posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La unión de la lipasa a la interfase agua-lípido requiere de la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa, con cambios conformacionales que forma una superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y demostrar la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares.

II. Objetivos: Demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y demostrar la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares.

III. Desarrollo:

Se demostró que los tubos adquirieron tonos rojizos, debido a la reacción de titulación con NaOH (Hidróxido de sodio).

IV. Análisis y descripción TUBO 1: Teniendo todas las condiciones menos el sustrato, por lo tanto, no hay actividad enzimática, al agregar la fenolftaleína (indicador de pH) y hacer la titulación con 0,1N NaOH se necesitaron 15 gotas de ello, alcanzando un pH alcalino y marcando a la sustancia en un color grosella. TUBO 2: Teniendo todas las condiciones menos el extracto pancreático no se presenta actividad enzimática, al agregar la fenolftaleína para realizar la titulación de con 0,1N NaOH, al tener un pH alcalino neutraliza al ácido y se necesita 35 gotas para cambiar de color a la sustancia. TUBO 3: Teniendo todas las sustancias necesarias, se logra la actividad enzimática de la enzima con el sustrato, pero en ausencia del cofactor no tendremos una mayor cantidad de producto (ácidos grasos), por lo que al agregar la fenolftaleína para realizar la titulación con 0.1N NaOH, se necesitan 40 gotas para que se pueda dar el cambio de color. TUBO 4: Teniendo este tubo todas las sustancias necesarias para que se logre la actividad enzimática, excepto agua destilada, la mezcla puede producir la máxima cantidad de producto y al no haber agua destilada este se convierte densa, por lo que al agregar la fenolftaleína y hacer la titulación con 0,1N de NaOH se necesitan 60 gotas para poder neutralizar el pH ácido y convertirlo en alcalino. La diferencia de las gotas de Hidróxido de sodio para cambiar de color en cada uno

de los tubos, se debe a la mayor cantidad de producto de ácido graso en la actividad enzimática, lo cual acidifica y baja el pH en la sustancia de los tubos.

V. Cuestionario: 1. ¿Cuál fue el propósito y /o finalidad de la práctica? La finalidad de esta práctica es la demostración de la acción de la enzima lipasa pancreática sobre las grasas, y la demostración de sales biliares como emulsificante de lípidos, además de cómo interviene en el proceso enzima sustrato.

2. Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica LIPASA PANCREÁTICA: La lipasa pancreática actúa sobre los triacilglicéridos para dar ácidos grasos libres y monoacilglicéridos. SALES BILIARES: Las sales biliares forman un complejo de anclaje en la interfase hidrofóbica/hidrofílica, en contacto con la lipasa pancreática y esta sea plenamente activa. LÍPIDOS: Las grasas y los aceites se componen de triglicéridos, compuesto del glicerol (1,2,3-tri hydroxypropane) y de 3 ácidos grasos para formar un triester.

3. ¿Cuál de los métodos para medir actividad enzimática fue empleado en esta práctica? El método que fue utilizado para medir la actividad enzimática fue la Titulación Ácido- Base. Para determinar el punto final se usan compuestos que tienen la propiedad de cambiar de color en el momento que finaliza la reacción entre la solución patrón y la solución que se valora, estos compuestos se denominan Indicadores. La elección del indicador y el conocimiento de su zona de viraje son aspectos esenciales en la valoración. Para la siguiente práctica se usará la fenolftaleína como indicador. Averiguar qué cantidad de ácido de concentración conocida es necesario para neutralizar una cantidad fija de base de concentración desconocida. En este caso el proceso se llama alcalimetría. El caso inverso, o sea, hallar la concentración del ácido se denomina acidimetría. En el experimento se hace uso de este método, con la finalidad de comprobar si se presenta actividad enzimática en las sustancias

produciendo ácidos grasos, y se acidifica la sustancia necesitando mayor cantidad del hidróxido de sodio y así determinar qué tan ácida es la sustancia.

4. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación de los resultados. Es un indicador común. La forma ácida de esta gran molécula es incolora; la forma de su base conjugada es rosa. La estructura de la forma básica permite que los electrones están deslocalizados a través de los tres anillos simil benceno de átomos de carbono, y el incremento en la deslocalización es parte de la causa del cambio de color. El pK de la fenolftaleína es 9,4, y por tanto el punto final tiene lugar en una solución levemente básica. El cambio de color de incoloro a rosado es notable a pH=8,2 y es completo a pH=10 En los resultados es incolora al ser añadida por estar presente los ácidos grasos libres productos de la acción de la lipasa y el viraje de color de la fenolftaleína a un color rosado se debe a que la solución alcanzada un pH entre 8 – 9 aproximadamente por la titulación con hidróxido de sodio. Los ácidos grasos indirectamente al ser liberados por la lipasa los que causan cambio de color, debido a que la titulación se lleva a cabo para hallar la cantidad de números equivalentes sean ácidos o básicos en la solución. Una vez que actúa la lipasa y se produce la hidrólisis, los ácidos grasos quedan libres produciendo un descenso del pH cuya magnitud depende del medio en que esté tamponado o no, el indicador cambia de pH como consecuencia del paso del pH de ácido a base.

5. Explique que son sustancias anfipáticas, emulsión de solución SUSTANCIAS ANFIPÁTICAS: Son aquellas que pueden sentir afinidad o repulsión al mismo tiempo por un determinado solvente, los solventes se clasifican químicamente como polares o apolares, hidrofílicos o hidrofóbicos. EMULSIÓN DE SOLUCIÓN: Por Emulsión química o emulsión se entiende que la unión más o menos homogénea de dos líquidos inmiscibles, ósea que no se mezclan totalmente el uno con el otro. Las emulsiones consisten en la dispersión de líquido o fase en el otro. Además, forman lo que ordinariamente se conoce como un coloide. Si bien estos dos términos se usan de manera indistinta, las emulsiones se diferencian de otros coloides porque se componen siempre de fases líquidas. Estas dos fases que componen una emulsión son siempre dos distintas:

FASE CONTINUA: Aquella que es predominante a la otra, ósea aquella dentro de la cual se dispersa uno de los líquidos que componen la emulsión, también se le denomina fase dispersante. FASE DISPERSA: La fase que es minoritaria frente a la otra, o sea, que se dispersa dentro de la fase dispersante.

6. Explique el proceso de emulsión de lípidos

● Las grasas de la dieta pasan por proceso de digestión por acción de las enzimas. ● Para que este complejo enzimático pueda actuar, se tienen que emulsionar los lípidos (para que pierdan la apolaridad), llevándose a cabo por las sales biliares (síntesis en el hígado y se almacenan en la vesícula biliar) en el intestino. Las sales biliares ejercen dos efectos importantes en el tubo digestivo: ● Acción detergente para las partículas de grasa de los alimentos, que disminuye la tensión superficial de las partículas y favorece la fragmentación de los glóbulos en otros de tamaño menor por efecto de la agitación del contenido intestinal, es la función emulsificadora o detergente de las sales biliares. ● Las sales biliares ayudan a la absorción de: los ácidos grasos; los monoglicéridos; el colesterol, y otros lípidos en el aparato digestivo.

7. En el ser humano, que enzimas participan en el proceso de digestión de lípidos, y cual es su función de cada una de ellas Clasificaron en 8 familias: las lipasas verdaderas, la familia II o GDSL, la familia III, la familia IV o HSL (lipasa sensible a hormona), la familia V, la familia VI, la familia VII y la familia VIII. Familia I o lipasas verdaderas: Las lipasas bacterianas verdaderas que primero se estudiaron y utilizaron industrialmente fueron las denominadas lipasas de pseudomonas, nombradas así por la bacteria de la que proceden. Estas enzimas fueron subdivididas en pseudomonas del grupo 1, 2 y 3, de acuerdo con la secuencia de sus aminoácidos. Familia II o GDSL: La familia II o GDSL está compuesta por glicina, ácido aspártico, una serina, una leucina y otra serina (GDSL). Existe el consenso de que las esterasas/lipasas tienen conservada una secuencia de aminoácidos denominado pentapéptido, que está formado por una glicina, una serina y un ácido aspártico, intercalándose entre cada uno de ellos un aminoácido cualquiera, es decir, glicina-X-serina-X-aspártico. La

característica más relevante de esta familia es que su pentapéptido no está formado por estos aminoácidos, sino por una glicina, seguido de un ácido aspártico, una serina, una leucina y una serina (en algunos casos), de ahí que se le denominara GDSLS. Familia III: Estructura tridimensional de la lipasa extracelular de Streptomyces exfoliatus (M86351). También, observaron que esta enzima presenta tanto la triada catalítica como la forma tridimensional característica de las α/β-hidrolasas y además, se vio que tiene una identidad del 20 % con el factor de plaqueta acetilhidrolasa activado (FPAAH) del plasma humano. Familia IV o lipasa sensible a hormona (LSH): Un número elevado de enzimas de esta familia presentan en la secuencia de aminoácidos una elevada similitud a la LSH de mamíferos, de ahí que se les haya denominado de la misma manera. Las enzimas de este linaje, además del pentapéptido característico de la superfamilia (G-X-S-X-G) de las lipasas/esterasas bacterianas, también presentan la secuencia His-GlyGly-Gly, que aparece localizada entre los aminoácidos 70 y 100 de las enzimas Familia V: En esta familia se encuentran enzimas de bacterias mesófilas (Pseudomonas oleovorans, Acetobacter pasteurianus y Haemophilus influenzae), psicrófilas (Moraxella sp) y termófilas (Sulfolobus solfataricus). Todas ellas muestran una similitud comprendida entre el 20 % y el 25 % con otras enzimas bacterianas no lipolíticas, como son las dehalogenasas y las haloperoxidasas. Todas poseen la triada catalítica formada por la serina, el glutámico o el aspártico y la histidina y el plegamiento característico de las α/β-hidrolasas Familia VI: Las lipasas bacterianas incluidas en esta familia son esterasas de pequeño peso molecular, entre 23 kDa y 26 kDa, y que curiosamente muestran un 40 % de homología con las lisofosfolipasas de eucariotas. Hasta la resolución de la estructura tridimensional de la carboxilesterasa de Pseudomonas fluorescens (1AUO), poco se sabía sobre esta familia. De hecho, lo que se conoce de esta familia es gracias a los estudios realizados en este tipo de enzimas. Familia VII: En esta familia se hallan esterasas con un peso molecular de aproximadamente unos 55 KDa. Todas las enzimas de esta familia presentan una elevada homología con acetilcolinesterasas de eucariotas y carboxylesterasas del intestino e hígado humano. La carboxilesterasa de Arthrobacter oxydans (Q01470) es particularmente activa sobre el herbicida fenilcarbamato, concretamente, hidroliza las cadenas laterales del carbamato. Familia VIII: Esta familia está formada por enzimas que tienen unos 380 aminoácidos y una elevada homología con algunas β-lactamasas de clase

C. La principal diferencia de esta familia con el resto, es que las tres enzimas que la forman, presentan unos 150 aminoácidos, desde la posición 50 hasta la 200, aproximadamente, que tiene una homología del 45 % con la proteína de Enterobacter cloacae (β-lactamasa).

8. Mediante un esquema, explique el proceso de absorción de lípidos, luego de su digestión.

Los lípidos requieren además una solubilización micelar por medio de los ácidos biliares de la bilis. Los productos finales de la digestión deben a continuación atravesar la pared del tubo digestivo y pasar a la sangre (absorción), para ser posteriormente distribuidos a todas las células del organismo

9. ¿Cuántas clases de lipasas actúan en el tubo digestivo y cuál es su rol? ¿Cuál es la importancia de las sales biliares? LIPASAS: La lipasa es una proteína (enzima) secretada por el páncreas dentro del intestino delgado. Ayuda a que el cuerpo absorba la grasa descomponiéndose en ácidos grasos. PEPTIDASA: proteasas o pepsina: Las peptidasas o proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas. Para ello,

utilizan una molécula de agua (mediante hidrólisis), por lo que se clasifican como hidrolasas AMILASAS O CARBOHIDRASAS: La amilasa es una enzima que ayuda a digerir los carbohidratos. Se produce en el páncreas y en las glándulas salivales. Cuando el páncreas está enfermo o inflamado, libera grandes cantidades de amilasa en la sangre. Se puede hacer un examen para medir el nivel de esta enzima en la sangre. IMPORTANCIA DE LAS SALES BILIARES: La función de las sales biliares en el duodeno es solubilizar los lípidos y las vitaminas liposolubles ingeridos y, de esta manera, facilitar su digestión y su absorción.

VI.

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