Practica 11 TransaminacióN PDF

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INTRODUCCIÓNEl nitrógeno es un elemento sumamente importante para los organismos ya que forma parte de los aminoácidos y los ácidos nucleicos, por lo que su utilización debe ser optimizada los más posible. Los aminoácidos que sobrepasan las necesidades metabólicas para sintetizar nuevas proteínas y ...

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BILÓGICAS PRÁCTICA 10 REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU RECONOCIMIENTO POR MEDIO DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL SANSÓN TEMICH RAÚL

7/12/2020

SANTES FOREY MIGUEL ANGEL

3IV1

ALMAZÁN HERNÁNDEZ OCTAVIO GARCÍA GUZMÁN RAMIRO LOZANO GARCÍAA CARLOS

INTRODUCCIÓN El nitrógeno es un elemento sumamente importante para los organismos ya que forma parte de los aminoácidos y los ácidos nucleicos, por lo que su utilización debe ser optimizada los más posible. Los aminoácidos que sobrepasan las necesidades metabólicas para sintetizar nuevas proteínas y otras biomoléculas no pueden almacenarse como ocurre con los ácidos grasos y la glucosa, por lo tanto, son catabolizados. El grupo -amino (nitrógeno) de los aminoácidos es separado del esqueleto de carbono, mediante el desarrollo coordinado de la transaminación y la desaminación oxidativa. Durante la transaminación, el grupo -amino de los aminoácidos proteicos, excepto lisina, treonina y prolina, se transfiere a un cetoácido (esqueleto de carbono), en consecuencia, se forma un nuevo aminoácido y se libera el cetoácido correspondiente al aminoácido inicial. Esta reacción es catalizada por las enzimas aminotransferasas, también llamadas

transaminasas, muchas de las cuales utilizan 1 -cetoglutarato como cetoácido, por lo que tarde o temprano, el grupo amino de todos los aminoacidos es dirigido al glutamato. El piridoxal fosfato (PLP), el cual se forma a partir de la vitamina B6 (piridoxina), es el grupo prostético de las aminotransferasas. El PLP se enlaza a la enzima y al sustrato formando lo que se conoce como base de Schiff. El grupo -amino es transferido al PLP creándose piridoxamina fosfato transitoriamente, posteriormente el cetoácido aceptor toma el grupo amino de la piridoxamina fosfato, con lo que se genera el aminoácido correspondiente y la piridoxamina fosfato vuelve a su estado original.

OBJETIVOS Cuantificar la actividad de la transaminasa ALAT/TGP presente en un extracto crudo de hígado empleando, un método cromatográfico y otro espectrofotométrico. RESULTADOS Muestra 0 5 10 15 20 P1 P2 T A

En el tubo 1 se encuentran 0 micromoles Concentración en el tubo 2 0.02μmoles μL 𝐶𝜇𝑚 = 0.6 μm

𝐶𝜇𝑚 = (30 μL)

Concentración en el tubo 3 Distancia R 26 cm 25.5 cm 25 cm 26 cm 24 cm 24 cm 33 cm 34 cm 32 cm

Rf 0.62 0.60 0.59 0.61 0.57 0.57 0.78 0.80 0.76

Se realiza después el calculo de los micromoles para poder elaborar una gráfica de la concentración de micromoles de glutamato contra la absorbancia, para esto se toma en cuenta el siguiente factor de conversión 20 μmoles 1 mL 0.02μmoles ( )= 1 mL 1000 μL μL

0.02μmoles μL 𝐶𝜇𝑚 = 1.2 μm

𝐶𝜇𝑚 = (60 μL)

Concentración en el tubo 4 0.02μmoles μL 𝐶𝜇𝑚 = 2.4 μm

𝐶𝜇𝑚 = (120 μL)

Concentración en el tubo 5 0.02μmoles μL 𝐶𝜇𝑚 = 3 μm

𝐶𝜇𝑚 = (150 μL)

Concentración en el tubo 6 0.02μmoles μL 𝐶𝜇𝑚 = 3.6 μm

𝐶𝜇𝑚 = (180 μL)

6 7 T P

Concentración en el tubo 7 0.02μmoles μL 𝐶𝜇𝑚 = 4.2 μm

𝐶𝜇𝑚 = (210 μL)

Después de haber obtenido las concentraciones de glutamato en terminos de micromoles se puede realizar la gráfica. Concentración de glutamato vs absorbancia

180 210 20 20

0.6

y = 0.1221x - 0.0745 R² = 0.8429

0.4 0.2 0

0

1

2

3

4

5

-0.2

La tabla de resultados quedaria de la siguiente manera al terminar de realizarse los cálculos necesarios Muestra Solución Absorbancia Glutamato Glutam 1 0 0 0 2 30 0.015 0.6 3 60 0.035 1.2 4 120 0.120 2.4 5 150 0.250 3

3.6 4.2 -

Gracias a la ecuación de la recta obtenida por la graficación de la concentración del glutamato y la absorbancia podemos determinar esta ecuación despejando la concentración: 𝐶𝜇𝑚 =

0.8

0.310 0.580 0.089 0.502

𝑦 + 0.0745 0.0244

Para calcular la concentración de ácido glutámico por la acción de la transaminasa se resta la absorbancia testigo y la absorbancia del problema y se sustituye después en la ecuación 𝐴𝑏𝑠 = 𝐴𝑏𝑠 𝑃 − 𝐴𝑏𝑠 𝑇 𝐴𝑏𝑠 = 0 − 502 − 0.089 = 0.413 𝐶𝜇𝑚 = 𝐶𝜇𝑚 =

𝑦 + 0.0745 0.0244

0.413 + 0.0745 0.0244

𝐶𝜇𝑚 = 3.99 𝜇𝑚

Con este valor se puede calcular la actividad de la transferasa en unidades arbitrarias 𝑈𝐴𝑇 =

Cμm

gramo hora

Al pesarse 65 g de higado de rata, se pasa homogeneizar el compuesto en 750 mL para la preparación total y después determinar la cantida de higado crudo en 1mL de solución Así que : 𝑈𝐴𝑇 =

3.99 μm 0.087 g ( 1 hora )

𝑈𝐴𝑇 = 46

𝜇𝑚 𝑔ℎ

DISCUSIÓN Con base a las graficas de resultados y a los datos calculados comprobamos el efecto que tiene la alanina sobre el ácido αcetoglutarico, sabiendo que la transferasa en la alanina se transferirá su grupo α amino al carbono α del α- cetoglutarato con la intervención piroxidal fosfato como coenzima formando así el glutamato y el α cetoalaninato de modo que apreciamos en

la primera de nuestras tablas de resultados dos manchas similares, es decir con el mismo Rf, la primera de ellas denominada P1 coincide con la aplicación de la muestra de solución de glutamato de 20µmoles/mL con esto podemos analizar que esta muestra presenta una concentración similar de glutamato que su prueba antecesora, la segunda de las muestras de un Rf de 0.78 se asemeja al resultado de la muestra de alanina que se estudió, esto nos hace pensar que se aprecia la presencia y separación de ambas sustancias después de la reacción de transaminación. En base a los resultados Rf de las muestras evaluadas por medio de la cromatografía podemos interpretar que algunas de las manchas se encontraban a una distancia similar, estas corresponden al acido glutámico, de modo que la mancha testigo quedará más lejos de la mancha de acido glutámico debido a que a este tubo no se le adicionó ácido α- cetoglutarico por lo que no efectuaría la reacción para producir ácido glutámico. Finalmente para obtener el resultado de la concentración de glutamato es necesario despreciar el producto formado en el experimento por lo

que se llevó a cabo la diferencia entre la absorción problema y la absorción testigo, dándonos así un resultado que se pudiese sustituir en la ecuación del despeje de la concentración, resultado una concentración final de 3.99 µmoles de glutamato formado.

REFERENCIAS •

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CONCLUSIÓN

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Mediante la enzima transaminasa pudimos comprobar la reacción de transaminasión que se llevo a cabo utilizando higado de rata, como sabemos en la transaminación el grupo amino de un aminoácido mediante la ayuda de una enzima, logra pasar a un alfa-cettoácido, obteniendo así 2 productos. Este proceso pudo ser cuantificado mediante el apoyo de las unidades de actividad de transferasa logrando apreciar un resultado notable en dicho proceso.

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Nelson D.L., Cox M.M., “Lehninger. Principios de Bioquímica”, 3a. Ed. Editorial Omega., Mckee, M. T.-J. R. (2003). Bioquímica. La base molecular de la vida (3rd ed.). MCGRAW HILL / INTERAMERICANA DE ESPAÑA, S.A. Herrera Castillón, E. (2011). Metabolismo general de aminoácidos. Álvarez, B. (2007). Metabolismo de Aminoácidos....