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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Práctica No. 3 Precipitación, separación y punto isoeléctrico de proteínas.

INTRODUCCIÓN También denominado punto isotónico al pH que se obtiene cuando una proteína es disuelta ausente de cualquier ion. En la mayor parte de las proteínas la solubilidad está dada por la interacción hidrofílica de las moléculas polares del agua y los grupos ionizados de las proteínas. Los factores principales que afectan la solubilidad de las proteínas son: fuerza iónica, pH, temperatura y la constante dieléctrica del disolvente. La solubilidad de una proteína a una determinada fuerza iónica varía con las clases de iones en solución; la solubilidad de una proteína a baja fuerza iónica se incrementa por lo general con la concentración salina, mientras que, a fuerzas iónicas elevadas se reduce la solubilidad de las proteínas, como la mayoría de las sustancias.

cationes en sales de metales pesados pueden formar un complejo con las moléculas de la proteína y precipitar como proteinatos metálicos. RESULTADOS Sobrenadante

Biuret positiva

Precipitado 1

positiva

Filtrado

negativa

Precipitado 2

positiva

Tabla 1 Salting out. Tabla 2 Precipitación por efecto del pH y disolventes. Tubo

1

Tubo

Los solventes orgánicos suelen ser buenos precipitantes de proteínas porque sus bajas constantes dieléctricas reducen el poder de solvatación de sus soluciones acuosas hacia los iones disueltos. OBJETIVO Obtener el punto isoeléctrico de la insulina mediante el análisis de sus propiedades de solubilidad a diferentes valores de pH. ANÁLISIS DE TÉCNICA Salting out: La adición de sales elimina el agua de la proteína hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas en libertad de combinarse intermolecularmente. Desnaturalización: Procedimiento por el cual se busca la precipitación de una proteína a través de la alteración estructural por medios físicos o químicos para eliminar su estructura tridimensional al eliminar estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias. Precipitación por metales pesados: En un medio alcalino, las proteínas son aniones, por lo qué, los

Interpretación Positiva porque hay proteínas Positiva porque hay proteínas Las proteínas precipitaron, están en el precipitado 2 Positiva porque hay proteínas.

Clara de huevo Clara de huevo filtrada filtrada Etanol ml HCl 0.1 ml NaOH Agua0.1 mlml Regulador de observaciones acetatos 0.1M (4.7ml) Agua Observaciones

1 3.02.0 ml

2 3.0 ml

1ml1.0

-

1ml - Precipitó -

2 3 2.0 3.0 ml - 1.0 1ml Sin precipitado

-

-

-

Precipitación media

Precipitación menor

Precipitación mayor

Tabla 3 Precipitación por modificación constante dieléctrica Tubo Clara de huevo filtrada ml HgCl2 5%

1

2

3

4

5

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

0.2 5 -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

0.2 5 -

-

Pb(C2H3O2)2 2%

-

0.2 5 -

NaCl 5%

-

-

0.2 5 -

Agua

-

-

-

AgNO3 2%

+

Observaciones

+

+

-

0.2 5 -

Tabla 4 precipitación por metales pesados Tubo

Ac.

Acetato

Insulin

pH

Observacione

de sodio 0.2 M (ml)

a 40U/ml

1

Acétic o 0.2 M (ml) 0.23

0.02

0.06ml

2

0.15

0.10

0.06ml

3

0.05

0.20

0.06ml

4

0.01

0.24

0.06ml

5

0.00

.025

0.06ml

s

3.6 7 4.5 6 5.3 4 5.4 2 9.0 6

No precipito

presencia de iones + y – que interactúen con las moléculas de agua, se pierde la interacción proteínaagua, por lo que precipita, sin embargo, la sal de Na solubilizó la proteína, pues se presentó el fenómeno de “salting in”.

Precipito

CONCLUSIONES Precipito No precipito No precipito

Tabla 5 determinación del punto isoeléctrico de la insulina DISCUSIÓN En la precipitación por salting out se buscaba la separación de la mayoría de las proteínas de la clara de huevo, por lo qué, primero se agregó una solución saturada de (NH4)2SO4 ya que es una sal altamente soluble y aumenta la interacción proteína-proteína produciendo que estas precipiten, al realizar la prueba de Biuret al sobrenadante y al precipitado uno ambas dieron positivas, posteriormente al sobrenadante se le adicionó sulfato de amonio y filtramos al volver a realizar la prueba de Biuret el filtrado dio negativo (azul) indicando que los restos proteicos estaban en el papel filtro y el precipitado dos positivo (violáceo) esto indica una separación de proteínas correcta. En la precipitación por efecto del pH y de solventes fue visible que en los tubos 1 (HCl) y 3 (regulador de acetatos) las proteínas precipitaron, en el tubo 2 (NaOH) la clara de huevo se solubilizo completamente debido a que la proteína se encontraba muy lejos de su punto isoeléctrico y como sabemos las proteínas en dicho punto presentan un mínimo de solubilidad, es decir, la clara de huevo a un pH básico su solubilidad es mayor. Al agregar el etanol se esperaba que las proteínas se solubilizaran menos, conforme a la teoría, lo cual fue cierto ya que, al añadir etanol a una solución acuosa de proteínas, disminuye la constante dieléctrica del agua, así como la interacción proteína-agua, y aumentando la interacción proteína-proteína favoreciendo así la precipitación.

Por otro lado, la precipitación con metales dio positivo para las sales de Hg, Ag y Pb pues en

Las variaciones de pH, presencia de sales y metales pesados afecta la solubilidad de las proteínas de manera directa, provocando cambios de carga en sus grupos R, altera su estructura, coagulándolas y facilitando su separación de acuerdo a la secuencia de aminoácidos. Las técnicas examinadas permiten el aislamiento e identificación de proteínas. BIBLIOGRAFÍA  Lehninger N., M. Cox. 2019. Principios de bioquímica. 7a Edición, Omega. España. ISBN 978-842-8216-67-8. 1304 pp.  Treijón J., P. Garrido, G. Blanco. 2009. Fundamentos de Bioquímica estructural. 2° Edición. Tébar, Madrid. ISBN 978-84-7360458-1 386 pp.

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 Roca P., J. Oliver, A. Rodríguez. 2003. Bioquímica. Técnicas y métodos. Hélice, España. ISBN 84-921124-8-4. 347 pp....