Practica 6 Técnicas DE Inoculacion PDF

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MICROBIOLOGÍALICENCIATURA QUIMICAREPORTES DE LABORATORIOANDRÉS I. GARCÍA ANTOLÍNSERGIO GARCÍA GONZÁLEZAXEL FERNANDO RUVALCABA RAZOCENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS E INGENIERAPráctica 6 Técnicas de transferencia ycaracterización del crecimiento bacterianoObjetivos de aprendizaje Aplicar las bases de ...

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MICROBIOLOGÍA LICENCIATURA QUIMICA REPORTES DE LABORATORIO ANDRÉS I. GARCÍA ANTOLÍN SERGIO GARCÍA GONZÁLEZ AXEL FERNANDO RUVALCABA RAZO CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS E INGENIERA

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Práctica 6 Técnicas de transferencia y caracterización del crecimiento bacteriano Objetivos de aprendizaje 1. Aplicar las bases de la técnica aséptica para evitar la contaminación durante la manipulación de cultivos, material y medios de cultivo estériles. 2. Conocer las técnicas de inoculación empleadas comúnmente para transferir bacterias en el laboratorio. 3. Transferir un inóculo de bacterias asépticamente de un medio de cultivo a otro para la lograr su propagación y/o aislamiento. 4. Identificar las características del crecimiento bacteriano en medios de cultivo líquidos, sólidos y semisólidos.

! Introducción La población de microorganismos desarrollada en un medio con nutrientes después de incubar se denomina cultivo, cuando éste contiene células idénticas de “una sola especie” se conoce como cultivo puro o axénico, de lo contrario es denominado cultivo mixto. En un cultivo mixto viven diferentes especies de forma conjunta, algunos de los cuales pueden ingresar fácilmente a partir de medios naturales como el suelo, agua, aire, plantas, animales o cuerpo humano. El cultivo axénico proviene de una sola célula, no son frecuentes en la naturaleza, se obtienen artificialmente bajo condiciones controladas en el laboratorio. Para obtener un cultivo puro se utiliza la técnica aséptica, ya que los  microorganismos contaminantes están presentes en el entorno y persona (aire del laboratorio, instrumentos y recipientes usados en los experimentos). El problema más común son los contaminantes aéreos, ya que el aire contiene polvo en suspensión que generalmente lleva comunidades de microorganismos. Como parte de la técnica aséptica, se incluye el uso de un asa de inoculación previamente esterilizada con calor seco con la flama del mechero. El asa de inoculación estéril es un instrumento esencial para realizar la transferencia de un inóculo de un cultivo microbiano de un medio a otro, los cuáles pueden depositarse en placas o tubos. En el laboratorio, el proceso de transferencia consiste en abrir la placa o tubo a una distancia no mayor de los 10- 15 cm cercana a la flama de mechero Bunsen, de tal modo que los contaminantes aéreos no ingresen en los cultivos de interés. Después de esterilizar el asa de inoculación se toma una pequeña porción de bacterias del medio de cultivo de origen y se transfiere a otro medio de cultivo (Figura 5.1 y 5.5). Posteriormente, los medios inoculados son incubados en condiciones de tiempo, temperatura y atmósfera gaseosa que faciliten su crecimiento. El desarrollo de un microorganismo en un medio se hace evidente por cambios como la turbidez y la formación de películas en la superficie de líquidos y semisólidos; o por el desarrollo de una alfombra microbiana, también conocida como “biomasa” en la superficie de medios sólidos. Los patrones de crecimiento en los medios son característicos de los requerimientos de los microorganismos y pueden ser un auxiliar en la identificación primaria de los mismos. La turbidez en los medios de cultivo líquidos se encuentra relacionada directamente con la cantidad de microorganismos; es observada a simple vista cuando se alcanza una concentración aproximada de 106 células/mL. La zona de crecimiento de un microorganismo en los medios de cultivo líquidos (Figura 5.2) puede ser un indicador de sus requerimientos de oxígeno. 38

Cuando una célula es separada de otras células con una técnica de aislamiento y tiene un espacio adecuado en la superficie de un medio sólido, ésta crecerá en forma de colonias. La evaluación de las características macroscópicas de las colonias se lleva a cabo usualmente mediante el examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar (Figuras 5.5-5.7). Para este propósito es útil hacer uso de una lupa, la cual facilita la apreciación de las características de las colonias. Los tubos que contienen medios sólidos no se utilizan comúnmente para evaluar la morfología, sino más bien para favorecer el desarrollo bacteriano, de modo que se produzca una cantidad suficiente de biomasa para el objetivo del estudio. Las colonias bacterianas tienen una forma, diámetro, elevación y borde (Figuras 5.5-5.7), en algunos casos color y olor característico, que pueden variar de acuerdo al medio en que se encuentren. La morfología de un microorganismo depende de la especie bacteriana y es constante en el medio de cultivo, bajo condiciones controladas. Debido a que las características de las colonias a menudo son uniformes, sirven para identificar microorganismos en los cultivos. Además de estas características, se requiere estudiar la fisiología, propiedades inmunológicas y genéticas de las bacterias para poder realizar una identificación completa. La morfología colonial (Figura 5.5) se deriva de una célula individual, pero es la característica de la masa celular. Por ejemplo, la pigmentación es aparente en la colonia, pero no en la célula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias, ésta se deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cápsula. En tanto, el diámetro de las colonias (Figura 5.3) se registra en mm y es una característica constante en las especies; puede ser diminuto hasta varios milímetros. Cuando la densidad microbiana es elevada, el diámetro puede parecer menor en la superficie de un medio sólido. Los bordes de las colonias bacterianas suelen ser lisos, ondulados, lobulados e irregulares (Figura 5.6). La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede moverse con el asa sobre el agar, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar. Algunas bacterias saprófitas producen colonias pigmentadas en los medios de cultivo. La coloración de las colonias incluye tonalidades rojas, anaranjadas, amarillas, etc. Staphylococcus aureus es una bacteria patógena que forma colonias amarillo dorado en medios para propósitos generales, como el agar soya tripticaseína. La evaluación de las características morfológicas de las colonias le permite al microbiólogo hacer una identificación preliminar de las bacterias en los medios de aislamiento. Pueden ser útiles en la selección de otros medios y pruebas diferenciales que completen la identificación de los aislamientos. La inspección inicial de las colonias para la identificación preliminar de las bacterias es una de las piedras fundamentales de la microbiología diagnóstica. Materiales Cultivos CEPAS Medios de cultivo Caja Petri con 15 mL de agar nutritivo Tubo de ensayo con 3 mL de agar soya tripticaseína inclinado 39

Tubo de ensayo con 3 mL de caldo nutritivo Tubo de ensayo con 3 mL de medio semisólido, SIM Equipo Incubadora a 37 °C Otros materiales Asa de inoculación redonda Asa de inoculación recta Gradilla Lupa Marcador de tinta permanente Mechero Bunsen Regla

Procedimiento Las cepas de las tres bacterias serán sembradas mediante las siguientes técnicas de transferencia (ae):

a. Transferencia de un caldo a otro caldo 1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Rotular un tubo de caldo nutritivo (CN) con las iniciales del medio de cultivo, el cultivo bacteriano, fecha, número del equipo y/o nombre del alumno. Esterilizar el asa de inoculación redonda con la llama del mechero Bunsen (5.1 a). Tomar el tubo de cultivo bacteriano con la mano y agitarlo antes de usar para incorporar las células sedimentadas. Re t i r a r e l t a p ó n d e l t u b o d e c u l t i v o b a c t e r i a n o c o n e l d e d o m e ñ i q u e de la mano dominante y mantenerlo en el dedo. Flamear la boca del tubo en la llama del mechero. Tomar la cantidad de inóculo con el asa redonda. Sacar el asa con el inóculo, flamear la boca del tubo del cultivo otra vez, taparlo y depositarlo en la gradilla. Tomar el tubo de caldo no inoculado, abrirlo con su dedo meñique y flamear la boca antes de su inoculación (Figura 5.1b). Introducir el asa con el inóculo en el caldo. Para dispersar a las bacterias, incline el tubo para permitir el contacto del caldo solo con la parte del asa que se esterilizó. Remover el asa del tubo y flamear la boca del mismo antes de taparlo con el dedo meñique. Esterilizar el asa antes de regresarla al área aséptica. Incubar el caldo inoculado a 37°C por 18 a 24 h. Observar si hay crecimiento y la zona en la que se encuentra (superficie, parte central, fondo, en todo el caldo), si presenta pigmentación u otras características (Figura 5.2). Registrar los resultados en las secciones correspondientes.

a. Transferencia de un agar inclinado a otro 1. Rotular con un marcador de tinta permanente un tubo de agar soya tripticaseína (AST). 2. Esterilizar el asa de inoculación. 40

3. Tomar el tubo que contiene el cultivo en la superficie inclinada del medio, y flamear la boca del tubo en la llama del mechero. 4. Tomar el inóculo en la parte más externa al bisel con el asa estéril. Sacar el asa, volver a flamear la boca del tubo, tapar y dejarlo en la gradilla. 5. Tomar el tubo con agar sin inocular, abrirlo y flamear la boca antes de su inoculación. 6. Insertar el asa con el inóculo en el fondo de la superficie inclinada del medio. Para dispersar a los microorganismos, hacer movimientos circulares y trazar una línea central a lo largo de la superficie, regresar y dibujar estrías con movimientos en forma de zigzag. 7. Remover el asa del tubo y flamear la boca del mismo antes de taparlo con el dedo meñique y esterilizar el asa. 8. Incubar el agar inclinado recién inoculado a 37°C por 18 a 24 h. 9. Describir si hay crecimiento en la superficie inclinada de agar y las características de crecimiento (Figura 5.3) 10. Registrar los resultados en la sección correspondiente.

a.

Toma de inóculo

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b.

Inoculación del caldo

Figura 5.1 Transferencia del inóculo a caldos: a. Toma de inóculo, b. Inoculación del caldo.

En la superficie

En la sub-superficie

En el fondo (Sedimento)

Uniforme en todo el líquido

Figura 5.2 Caracterización del crecimiento bacteriano en medios líquidos.

Filiforme

Irregular

Formación de fragmentos

Esparcido

Rizoide

Arborescente

Figura 5.3 Caracterización del crecimiento bacteriano en medios sólidos inclinados.

b. Transferencia de un cultivo bacteriano en caja de Petri a una caja Petri por estría 1. Rotular la base de una caja Petri con un marcador de tinta permanente para incluir las iniciales del medio de cultivo, bacteria, fecha, número del equipo y/o nombre del alumno. 2. Esterilizar el asa de inoculación redonda con la llama del mechero Bunsen hasta que llegue al rojo vivo. Debe ca le nt ar el ala mb re compl et o. Mante nga el as a cerca de l mechero y permita enfriar en condiciones asépticas antes de usar. 3. Tomar la cantidad de biomasa bacteriana con el asa de inoculación redonda. 4. Tomar la caja Petri con el agar nutritivo (AN) no inoculado y abrirla manteniéndola en área aséptica. 5. Dividir imaginariamente la superficie del agar en cuatro cuadrantes y asignar un número en sentido horario de izquierda a derecha. Depositar el asa con el inóculo sobre los cuadrantes 1 y 4 para hacer una línea con el propósito de descargar y estriar la biomasa con movimientos de zigzag. 6. Esterilizar el asa (Figura 5.1a), dejarla enfriar y volver a estriar la superficie del cuadrante 2 para lo cual deberá trazar una línea perpendicular a partir de la mitad de la primera zona estriada. 7. Repetir el procedimiento hasta terminar con la superficie del medio de cultivo y esterilizar el asa (Figura 5.4). 8. Incubar la caja inoculada a 37 °C por 18 a 24 h. 9. Describir si hay crecimiento en las placas de agar y si el cultivo es puro. Observar el tamaño, elevación, color y borde de las colonias aisladas de cada cepa cultivada (Figuras 5.5-5.7) 10. Registrar los resultados en las secciones correspondientes.

Figura 5.4 Transferencia a caja Petri por estría. 43

Puntiforme

Irregular

Circular

Rizoide

Filamentosa

Fusiforme

Figura 5.5 Formas comunes de colonias de microorganismos.

Entero Aserrado

Ondulado

Lobulado

Filamentoso

Rizado

Figura 5.6 Bordes o márgenes de colonias de microorganismos.

Plana

Monticular

Elevada

Umbeliforme

Convexa

Umbilicada

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Figura 5.7 Elevaciones comunes de colonias de microorganismos.

c. Transferencia de una colonia a tubos con medio de cultivo inclinado 1. Rotular con un marcador un tubo de AST. 2. Esterilizar el asa de inoculación recta con la llama del mechero Bunsen. 3. Con la mano libre tomar la caja que contiene el cultivo de la bacteria, dejar la tapa en la superficie de la meseta con la tapa hacia arriba. 4. Inclinar la caja del cultivo para permitir tomar la colonia con un asa recta. Con el asa estéril tocar el centro de la colonia con un movimiento recto. Es importante la orientación del asa al momento de tomar la biomasa de la colonia, ya que puede haber micro colonias alrededor de la misma que no sean perceptibles al ojo. Lo anterior se traducirá en un cultivo contaminado. 5. Tomar el tubo con agar inclinado sin inocular, abrirlo y flamear la boca antes de su inoculación. 6. Insertar el asa con el inóculo en el fondo de la superficie inclinada del medio. Para dispersar a los microorganismos, hacer movimientos circulares y trazar una línea central a lo largo de la superficie, regresar y dibujar estrías con movimientos en forma de zigzag. 7. Remover el asa del tubo y flamear la boca del mismo antes de taparlo con su dedo meñique (Figura 5.1). 8. Esterilizar el asa en el área aséptica antes de regresarla (Figura 5.1a). 9. Incubar el agar inclinado inoculado a 37°C por 18 a 24 h. 10. Registrar los resultados en la sección correspondiente. d. Transferencia de una colonia a tubos con medio de cultivo semisólido 1. Rotular con un marcador de tinta permanente un tubo de medio semisólido (SIM) con las iniciales del medio de cultivo, el cultivo bacteriano, fecha, número del equipo y/o nombre del alumno. 2. Esterilizar el asa de inoculación recta con la llama del mechero Bunsen. 3. Tomar con la mano la caja que contiene el cultivo bacteriano, invertir la caja para dejar la tapa en la superficie de la meseta del laboratorio, de manera que quede hacia arriba. 4. Inclinar la caja del cultivo para permitir tomar con un movimiento recto la colonia. 5. Tomar el tubo con SIM sin inocular, abrirlo con el dedo meñique y flamear la boca antes de su inoculación. 6. Insertar el asa con el inóculo en la superficie del medio hasta 0.5 cm antes del fondo. Para dispersar a los microorganismos, trazar una línea central a lo largo del medio. 7. Remover el asa del tubo y flamear la boca del mismo antes de tapar con el dedo meñique. 8. Esterilizar el asa en el área aséptica antes de regresarla (Figura 5.1a). 9. Incubar el medio semisólido recién inoculado a 37°C por 18 a 24 h. 10. Registrar los resultados en la sección correspondiente.

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Resultados Complete la información con las características del crecimiento bacteriano de los cultivos en la siguiente Tabla. Dibuje el cultivo bacteriano obtenido y coloree. a. Bacteria sembrada. #10 Caldo - Caldo Medio de destino:caldo Tipo de desarrollo:precipitado Zona del medio en que crece:fondo Color:turbio

Agar inclinado - Agar inclinado Medio de destino:agar inclinado Tipo de desarrollo:no hubo

Caja de Petri - Caja de Petri Medio de destino: Forma:estriado Elevación:prominente Bordes: Color:amarillenta Caja de Petri - medios semisólidos

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Medio de destino: Movilidad:inoculacion limpia Color: Amarillo Otras características:

b. Bacteria sembrada #9 Caldo - Caldo Medio de destino:caldo Tipo de desarrollo:precipitado Zona del medio en que crece:fondo Color:turbio

Agar inclinado - Agar inclinado Medio de destino:agar inclinado

Tipo de desarrollo:no hubo

Caja de Petri - Caja de Petri

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Medio de destino:agar nutritivo Forma:estriado Elevación: poca Bordes: Color:blanco Caja de Petri - medio semisólido Medio de destino:sim Movilidad: inoculación de forma limpia Color:negro, amarillo y naranja Otras características: Desde la inoculación se tornó negro y se hizo una nube de color gris

c. Bacteria sembrada #20 Caldo - Caldo Medio de destino: caldo Tipo de desarrollo: pequeño precipitado Zona del medio en que crece: en la parte inferior Color: turbio

Caja de Petri - Caja de Petri

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Medio de destino:agar nutritivo Forma:estriado Elevación:ligeramente Bordes: Color:transparente

Caja de Petri - agar inclinado Medio de destino:agar inclinado Tipo de desarrollo: no logró desarrollarse

Caja de Petri - medios semisólidos Medio de destino: sim

Movilidad: no se hizo una inoculacion de forma limpia Color:amarillento y tonalidades negras Otras características: se empezó a crecer en la parte inferior como si fuese una nube

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