Práctica - Métodos espectroscópicos y Curva estándar de proteína PDF

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El documento es una breve revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de curvas estándar de proteínas. Comprende la primera práctica de la materia de Bioquímica Experimental de la Facultad de Química de la UNAM.
Se describen dos métodos para la cuantificación de proteínas, así como la...

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Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Química. Bioquímica Experimental. Depto. De Bioquímica. Titulares: Dr. Ávila Chávez Euclides / Dra. Mendoza Rodríguez Carmen Adriana.

«Revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de curva estándar de proteína» Por: Carrizosa Muñoz Cecilia1 / Chavira Tapia Juan Miguel2 / Hernández Benítez Luis Joshua3 / Torres Santander Fernando.4 Resumen. Introducción: La cuantificación de proteínas presentes en una muestra biológica es de carácter fundamental en estudios de carácter clínico, ya que puede proveer información acerca de determinados estados patológicos. La absorbancia [A] (capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda), es aprovechada por la técnica de espectrofotometría UV-visible, para ayudar a la averiguación de la concentración de proteínas presentes en determinadas muestras. Objetivos: Determinar la eficacia y utilidad de la espectrofotometría UV y visible como métodos de cuantificación de proteínas, mediante la lectura de la absorbancia [A] de muestras biológicas con contenido proteico. Material y método: Se consideraron dos métodos, uno directo que hace uso de la espectrofotometría UV mientras que el segundo utiliza la luz visible (método de Lowry); se trabajó la albúmina de suero bovino (BSA) como sustancia patrón para la construcción de las curvas estándar.

Resultados y discusión: En ambos métodos se denota una clara relación proporcional entre la absorbancia de la muestra y la concentración proteica de la misma, además de haber una mayor sensibilidad por parte del método de Lowry, sin embargo se observó que la relación absorbancia-concentración también depende de la reactividad de la proteína ante los reactivos utilizados. Conclusiones: A pesar de haber ciertas desventajas en el uso de ambos métodos, la espectrofotometría UV-visible ofrece una estimación bastante aceptable en la realización de curvas de calibración y la consecuente determinación de la concentración proteica de una muestra. INTRODUCCIÓN. El espectrofotómetro, es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de investigación. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con las sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de características especiales es

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guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda la cual pasa a través de una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la sustancia. La ley de Beer Lambert, se conoce también como ley de Beer o de BeerLambert-Bouguer identifica la relación existente entre la concentración de la muestra y la intensidad de la luz transmitida a través de la misma. Con relación a la ley en mención hay implícitos dos conceptos: transmitancia [T] y absorbancia [A]. La transmitancia [T] es la fracción de la luz incidente que a una determinada longitud de onda pasa a través de la muestra. La concentración de moléculas absorbentes de luz en la muestra es proporcional a la absorbancia [A] de la muestra. (Castellanos, 1989). Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unirse a ciertos colorantes (Segal, 2005). Sin embargo, existe una gran variedad de métodos para determinar la cantidad de proteína presente en tejidos y fluidos: los métodos de Lowry (1951), Biuret (Layne, 1957) y Bradford (1976). El fundamento del método de Lowry, es la formación del complejo proteína-Cu, el cual reduce el fosfomolibdato presente en el reactivo de Folin-Ciocalteu produciendo un color azul determinable colorimétricamente. Este método, utilizado desde 1951, ha sido objeto de numerosas revisiones, particularmente en lo que respecta a la estabilidad de la reacción en función del tiempo, temperatura y longitud de onda apropiada para la medida del color. (Stauffer, 1995) Por ello, mediante la construcción de una curva de calibración utilizando albúmina como “proteína modelo”, se determinó la concentración de proteínas presentes en una muestra problema. La utilización de esta proteína se ha convertido en un estándar preferido para la realización de este tipo de pruebas debido a su bajo costo así como a su disponibilidad en forma pura.

HIPÓTESIS. La absorbancia de las preparaciones proteicas aumentará en función de su concentración en el método directo y tras la adición de los reactivos A & B correspondientes al método de Lowry. OBJETIVOS. Comprender la importancia de las curvas de calibración así como su utilidad en bioquímica experimental para la determinación de ciertos parámetros como la concentración proteica en una muestra; en este ensayo, para la determinación de BSA utilizando el método de Lowry y el método directo, de la misma forma evaluar la efectividad, sensibilidad y ventajas/desventajas de ambas metodologías. Desarrollar la habilidad sobre el manejo adecuado de instrumentos comunes en el laboratorio de bioquímica experimental como micropipetas y espectrofotómetro.

MATERIAL Y MÉTODOS. La parte experimental de esta práctica se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del manual de Bioquímica Experimental ediciones 2008 y 2013 de la Facultad de Química, UNAM. RESULTADOS. En la Figura 1 se muestra la curva de calibración de BSA según el método colorimétrico de Lowry, donde se observa notoriamente el aumento de la absorbancia en función de la cantidad de BSA. De igual forma en la Figura 2 se observa el aumento de la absorbancia en función de la cantidad de proteína empleando el método directo. La concentración de BSA presente en las muestras resultaron de 0.29mg/mL y 0.31mg/mL para el tubo 9 y 10 del método de Lowry y de 0.46mg/mL y 0.37mg/mL para 9 y 10 en el método directo respectivamente. En la Figura 3 se muestra la comparación de las curvas de calibración de BSA empleando el método de Lowry y el método directo, donde se aprecia mayor sensibilidad en el método de Lowry sobre el método directo.

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0.7

Absorbancia (A750nm)

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

5

10

15

20

25

30

35

150

180

210

BSA (μg)

Figura 1. Curva de calibración de BSA según el método de Lowry.

0.3

Absorbancia (A280nm)

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0

30

60

90

120

Figura 2. Curva de calibración de BSA según el método directo.

0.7

0.3

0.6

0.25

0.5

0.2

0.4 0.15 0.3 0.1

0.2

0.05

0.1

0

0 0

30

60

90

120

150

BSA (μg) Met Lowry

Met directo

180

210

Absorbancia (A280nm)

Absorbancia (A750nm)

BSA (μg)

Figura 3. Curva de calibración de proteína BSA. Figura que muestra la comparación de dos metodologías; Lowry y directo, donde se observa mayor sensibilidad en el método de Lowry.

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La Tabla 1 muestra el coeficiente de variación (CV) de la toma de los volúmenes para la preparación de la curva estándar de proteína, donde se observa que a menores volúmenes pipeteados el error se hace más

notorio, así mismo la Figura 4 representa la curva de calibración de BSA grupal, donde se observa el comportamiento esperado, aumento de la absorbancia en función de la cantidad de BSA en la muestra.

Tabla 1. Coeficiente de variación (en porcentaje) calculado para la curva de calibración de BSA según el método colorido de Lowry.

Masa BSA (μg) 0 5 10 15 20 25 30 35

A750nm promedio

0 0.149 0.259 0.356 0.466 0.539 0.650 0.75

SD

CV (%)

0 0.040 0.036 0.031 0.043 0.065 0.059 0.082

27.19 13.88 8.84 9.36 12.04 9.04 10.97

0.8

A750nm promedio

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

5

10

15

20

25

BSA (μg)

30

35

Figura 4. Curva de calibración grupal de proteína BSA promedio. La curva se construyó graficando la A750nm promedio de cinco series de muestras a diferentes concentraciones de BSA según la metodología de Lowry.

DISCUSIÓN. En el método directo de la determinación de proteínas en una muestra, se mide la absorbancia de la muestra a 280nm, donde se aprovecha la propiedad de los aminoácidos que contienen compuestos aromáticos en sus cadenas laterales de absorber intensamente la radiación UV. Por lo tanto, las proteínas que poseen un gran número de estos aminoácidos absorben de manera proporcional a la cantidad de dichos aminoácidos. El uso de esta metodología nos arroja resultados menos sensibles (como se observa en la Figura 3) que un método colorimétrico, como lo es el método de Lowry.

Ahmed (2004) reporta que los métodos colorimétricos son relativamente sensibles, y tan poco como 1ng de proteína puede ser leído en el espectrofotómetro, pero ninguno de estos métodos puede proveer una información precisa debido a la variabilidad de la reactividad de los aminoácidos de la proteína con el reactivo utilizado, así como la dependencia de estas reacciones con el tiempo de incubación y la temperatura.

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La determinación realizada utilizando la luz visible, se llevó a cabo mediante el método de Lowry: un método colorimétrico de cuantificación, es decir, las proteínas se sometieron a una reacción, cuyo producto posee un color que puede ser leído en un espectrofotómetro. La sensibilidad del procedimiento de Lowry es moderadamente constante de proteínas a proteínas, y actualmente es usado ampliamente pues las estimaciones obtenidas son una alternativa completamente aceptable (Walker, 2002). Dicho método colorimétrico está basado en la reacción de Biuret de proteínas produciendo una reacción que genera un color azul, que se leyó a una absorbancia de 750nm, dentro del espectro visible. Esta reacción en general se lleva a cabo en dos pasos, razón por la cual se debe esperar un tiempo determinado de incubación para dar oportunidad de que la reacción se llevé a cabo por completo:

proteína con los reactivos añadidos, habrá más productos coloridos de esta reacción, y así, un color más fuerte de estos productos, llevando a un aumento de la absorbancia. Esto lo podemos observar claramente en los resultados (Figura 1 y Figura 2), ya que con el aumento de la cantidad de proteína (BSA), la absorbancia aumenta proporcionalmente. Una de las ventajas del método directo sobre el método colorimétrico de Lowry es la rapidez en la que la determinación se lleva a cabo, pues no es necesario llevar a cabo ninguna reacción para la cuantificación de proteínas, por lo tanto no hay que esperar un periodo de incubación previo a la medición de las absorbancias. Así mismo, podemos mencionar que, al no llevarse a cabo ninguna reacción, la proteína permanece “completa”, no se destruye, a diferencia del método de Lowry, pues, como se mencionó anteriormente, la proteína oxida al reactivo de Lowry para producir/intensificar el color azul, por lo tanto, la proteína no permanece igual, se altera su estructura tras la reacción.

a) Los enlaces peptídicos de las proteínas a estudiar reaccionan con el sulfato cúprico bajo condiciones alcalinas, produciendo el ion Cu+ (Reacción de Biuret); y CONCLUSIONES. b) La subsecuente reducción del reactivo de Folin por La alta sensibilidad observada en el método de Lowry parte de la proteína tratado con cobre. En esta segunda indica una gran ventaja sobre el método directo al poder reacción es donde se intensifica el color. (Reacción de proporcionar la detección de una respuesta (absorbancia) a Folin-Ciocalteau). concentraciones de proteína bastante reducidas, lo cual es Hay dos grandes desventajas del método: a) La conveniente al momento de querer optimizar los reactivos cantidad de color varía con cada proteína; y b) El color no utilizados en el laboratorio, además de ofrecer una es estrictamente proporcional a la concentración de metodología que resulta conveniente en el hecho de que proteínas (Lowry, 1951). Esto se debe a la reacción puede describir un comportamiento. reactivo-aminoácidos, ya que, por ejemplo, los Al provocar que la proteína reaccione con los reactivos aminoácidos tirosina y triptófano participan fuertemente en A y B del método de Lowry, permite que se establezca una la generación de color, mientras que en menor medida se relación proporcional entre la absorbancia en el espectro de debe a los aminoácidos cisteína e histidina. Esto nos lleva la luz visible y la cantidad de proteína que logró reaccionar a pensar que proteínas ricas en los primeros aminoácidos con los reactivos, sin embargo ofrece una desventaja que mencionados generarán un color fuerte, mientras que si se depende del tiempo de reacción. trata de los últimos el color puede ser más suave. Entonces podemos creer que no es un método preciso o Los métodos espectroscópicos ofrecen una alternativa completamente confiable, pero si podemos considerarlo un fácil y relativamente barata de poder determinar la método aproximado, pues esto se debe a la variabilidad de concentración de determinadas sustancias ya sea con la reactividad de los aminoácidos que posee la proteína de propiedades colorimétricas o no, con bastante precisión y estudio. confiabilidad. Por lo tanto, confirmamos que la cantidad de aminoácidos reaccionantes con el reactivo añadido es REFERENCIAS. proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra analizada, ya que denota que a medida que la Ahmed, Hafiz. 2004. Principles and reactions of Protein proteína se encuentre en mayor proporción en una muestra, Extraction, Purification, and Characterization. Editorial habrá más aminoácidos reaccionantes que absorban la luz CRC Press. EUA. Págs. 42, 46-47. incidida sobre ellos. De esta manera, entre más reaccione la

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Castellanos, J. 1989. Sistema de capacitación técnica, Mantenimiento de equipo médico, Módulo Laboratorio Clínico, submódulo 2, espectrofotómetro. Bogotá, Colombia, Fondo Nacional Hospitalario, División de Ingeniería y Mantenimiento. Lowry, O. H. & Cols. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. The Journal Of Biological Chemistry. 193: 265-275. Sánchez, S. et al. 2008. Manual de prácticas de Bioquímica experimental. México, Facultad de Química, UNAM. Págs. 8-11. Sánchez, S. et al. 2013. Manual de prácticas de Bioquímica experimental. México, Facultad de Química, UNAM. Págs. 7-10. Segal, C. 2005. Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial publidisia. Stauffer, C. 1975. Linear standard curve for the Folin Lowry determination of protein. Anal. Biochem., 69, 646. Walker, J.M. 2002. The Protein Protocols Handbook. Editorial Humana Press. EUA. Págs. 7-9.

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