PRACTICA Nº1 - ESTUDIO DE PROTOZOARIOS DE VIDA LIBRE (NO PARÁSITOS) PDF

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T., A. MORALES H., E. BOCARDO D., Y. MEDINA V., C. MEDINA P.201 9SESION PRACTICA Nº 1TEMA: ESTUDIO DE PROTOZOARIOS DE VIDALIBRE (NO PARÁSITOS)INTRODUCCIONL a palabra "Protozoo" significa etimológicamente "primeros animales" o "animales primitivos". Constituyen un grupo heterogéneo formado por aproxi...

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GUÍA DE PRACTICAS ZOOLOGÍA DE INVERTEBRADOS T., A. MORALES H., E. BOCARDO D., Y. MEDINA V., C. MEDINA P.

E. LÓPEZ

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SESION PRACTICA Nº 1 TEMA:

ESTUDIO DE PROTOZOARIOS DE VIDA LIBRE (NO PARÁSITOS)

INTRODUCCION La palabra "Protozoo" significa etimológicamente "primeros animales" o "animales primitivos". Constituyen un grupo heterogéneo formado por aproximadamente 50000 organismos unicelulares que poseen orgánulos celulares típicos (eucariotas) rodeados por una membrana. Puesto que casi todos son móviles y muchos de ellos son heterotróficos, hasta hace algún tiempo se consideraba que este grupo era sólo un Phylum dentro del Reino Animalia: el Phylum Protozoa. En la actualidad, el grupo está formado por varios phyla unicelulares diferentes, los cuales, junto con la mayor parte de los phyla de algas, pertenecen al Reino Protista. Los Protozoarios como organismos han evolucionado a nivel celular, alcanzando diferenciación protoplasmática y por lo tanto su complejidad se manifiesta en el número y naturaleza de orgánulos. Forman un grupo de organismos microscópicos unicelulares, con una gran diversidad en complejidad, tamaño y comportamiento. Siendo el cuerpo de los Protozoarios formado por una sola célula, manifiesta todas las características inherentes a la materia viviente y por lo tanto realiza las funciones propias de un animal superior. El nivel de organización unicelular es la única característica descriptiva unificadora de los protozoarios, pues en todos los demás aspectos exhiben una diversidad extrema. Además, entre éstos se observan todos los tipos de simetría, una amplia gama de grados de complejidad estructural, y adaptaciones para la vida en todo tipo de ambientes. Como organismos, los protozoarios se han conservado en el nivel unicelular, aunque han evolucionado a lo largo de muchas líneas por especialización de partes del protoplasma (orgánulos) o de la estructura esquelética. Existen protozoarios donde quiera que haya humedad: en el mar, en todo tipo de aguas dulces y en el suelo; hay especies comensales, mutualistas y muchas parásitas. La locomoción la realizan mediante flagelos, cilios y seudópodos. Su nutrición puede ser holozoica, holofítica y saprozoica. Se reproducen sexual y asexualmente. Unos son solitarios y otros coloniales. Aunque la gran mayoría viven como individuos solitarios, existen muchas formas coloniales. Algunas de éstas, como las especies de Volvox, tienen tal grado de interdependencia celular que se aproximan a un verdadero nivel estructural pluricelular. Las especies coloniales o solitarias pueden ser móviles o sésiles. En el estudio de los Protozoarios se utilizan determinadas técnicas microscópicas, estas son: exámenes en fresco, que nos permiten observar las formas

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corporales, su locomoción y otras actitudes y reacciones; con colorantes vitales que permiten ampliar las observaciones hacia algunos procesos intracelulares, así como permiten la observación del movimiento ciliar y flagelar; por último las técnicas de fijación y montaje temporal y permanente, en las que se utilizan diversas técnicas de coloración que posibilitan el conocimiento de toda la organización celular de los Protozoarios, haciendo resaltar aquellos caracteres que nos interesan en su estudio. Para las técnicas en las que se utilizan colorantes existen toda una gama de ellos, de esta manera su empleo permite teñir diversas estructuras, tales como: núcleo, cilios, flagelos, mitocondrias y otras estructuras citoplasmáticas.

COLECTA Y CONSERVACION La colecta de protozoarios en general ofrece pocas dificultades, ya que habitan en casi cualquier tipo de agua; pero la búsqueda de un determinado grupo o especie es difícil y depende del conocimiento de su hábitat y hábitos. Son múltiples los factores que pueden determinar que en cierto lugar habite una determinada población de protozoarios. Los Rizópodos están tipificados por la presencia de seudópodos. Estos son extensiones no permanentes del cuerpo que funcionan como órganos de locomoción y alimentación. La forma de los seudópodos varía considerablemente: pueden ser salientes redondeados (lobopodios), como en la conocida Amoeba o estructuras filamentosas largas y finas (filopodios), y en ciertas especies, los seudópodos poseen túbulos axiales (axopodios). La diversidad de los Protozoos Rizópodos en las subdivisiones que presenta el grupo Amoebinos comprende organismos desnudos, normalmente con lobopodios; los Testáceos y los Foraminíferos poseen una concha externa consistente o testa y seudópodos de tipo Rizópodo o filopodios; los Heliozoos carecen de testa externa, pero sus seudópodos presentan ejes rígidos (axopodios); y los Radiolarios tienen una cápsula silícea interna que proporciona soporte esquelético al cuerpo, a la vez que exhiben numerosos seudopodios filamentosos. La testa puede ser una estructura débil formada por la adherencia de partículas orgánicas o inorgánicas en la superficie del organismo, como ocurre en muchos Testáceos, o bien puede consistir en una sólida concha constituida por material orgánico o inorgánico que impone al organismo una forma rígida. Las testas calcáreas de algunos Foraminíferos y las conchas silíceas de muchos Radiolarios presentan una enorme complejidad arquitectónica y son de gran belleza. Los Mastigóforos comprenden aquellos Protozoos comúnmente denominados

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"Flagelados". Todos ellos poseen uno o más flagelos, que utilizan principalmente para la locomoción, aunque también contribuyen en la alimentación. El Grupo se subdivide en dos: Fitomastiginos y los Zoomastiginos. Los primeros se caracterizan por la presencia de un pigmento fotosintético, la clorofila, y normalmente poseen uno o dos flagelos. En cambio, los Zoomastiginos no tienen clorofila, dependiendo del medio externo para obtener partículas alimenticias. Además los Zoomastiginos pueden poseer muchos flagelos, algunos de los cuales forman órganos más complejos. Entre los fitomastiginos más conocidos figuran Euglena y Chlamydomonas, solitarios; el colonial Volvox y los dinoflagelados Ceratium y Noctiluca. Los organismos patógenos del género Trypanosoma, de gran importancia médica pertenecen a los Zoomastiginos. Los Protozoos flagelados se encuentran en todos los tipos de hábitat, ya sea en el mar, en las aguas dulces o en el suelo. Pueden ser de vidas libres, solitarias o coloniales, y también parásitos. Los Esporozoos son exclusivamente endozoicos, es decir, todos ellos viven en la cavidad corporal o en los tejidos de un animal hospedador. Los miembros del grupo tienen ciclos vitales complejos, y reciben su nombre del proceso de formación de esporas (esporogonia) que forma parte del ciclo vital. En la mayoría de los Esporozoos dicho ciclo incluye un estado intracelular, con muchas especies de importancia médica. Los Ciliados, como indica su nombre, se caracterizan por la presencia de cilios en la superficie corporal. Esta condición es patente en los conocidos Paramecium y Tetrahymena, cuyo cuerpo está cubierto por "una capa de finos cabellos". La forma corporal es muy variable, así como la disposición de los cilios, que pueden aparecer modificados como orgánulos complejos. Como ocurre con los Flagelados, los Ciliados son muy comunes y se encuentran en todo tipo de hábitats. Muchos son de vida libre, pero hay formas unidas al substrato por un pedúnculo y formas parásitas. Ciliados, flagelados y rizópodos se pueden encontrar en cualquier muestra de agua, aunque algunos grupos se desarrollan en condiciones particulares. Así, por ejemplo, en la superficie de los estanques y de los lagos o de los arroyos de aguas tranquilas, y a profundidades que pueden variar desde la superficie hasta 30 cm, existen la mayor parte de los flagelados con clorofila, tales como, Euglena. Este género habita en aguas dulces, donde la vegetación flotante y las superficies espumosas casi siempre delatan su presencia. En estos sitios, la colecta se hace desplazando por la superficie del agua un frasco de boca ancha. Se recomienda usar redes de plancton de 200 micras por pulgada cuadrada para colectar Euglenas, tomando muestras entre 25 a 60 cm de profundidad, además de las muestras superficiales y del fondo. Muchas especies de rizópodos, entre ellas las amibas o géneros como Arcella, Pelomyxa y Difflugia se encuentran en las aguas estancadas sombreadas o que

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tengan un mínimo de acceso a la radiación solar. Se desplazan sobre los fondos lodosos cubiertos de vegetación muerta o de materia orgánica en descomposición. El material colectado debe ponerse en frascos limpios y llevarse al laboratorio. Los Protozoarios marinos abundan también en gran cantidad y casi todos comprenden especies cuya distribución es muy amplia. Se pueden encontrar a cualquier profundidad. Para colectar muestras representativas, se necesita usar redes finas o redes de plancton. Los Rizópodos del grupo de los Foraminíferos y Radiolarios abundan en casi todos los mares y sus caparazones llegan a acumularse por millones en el fondo de algunas áreas marinas. Se puede obtener Foraminíferos vivos en las coralinas y otras algas marinas, tanto extrayéndolos con ayuda de una lente como utilizando un filtro grueso unido a una malla de seda. El filtro debe sumergirse en agua de mar y sobre él se colocan algunos puñados de algas, etc. La malla de seda atrapará los organismos que atraviesen el filtro. Se puede poner también fango o arena fina del fondo del mar en recipientes con agua de mar y agitar. Los Foraminíferos se hundirán hacia el fondo, y las partículas más ligeras se arrastran con el agua. Los caparazones de Foraminíferos se pueden colectar fácilmente con la arena fina depositada por la espuma de las olas que desaparecen suavemente sobre las playas extensas. Esta arenilla, después de secada, se observa en el laboratorio bajo un microscopio de disección. Los pequeños caparazones se aíslan con el pincel fino o con agujas de disección, y se pegan sobre preparaciones o sobre cartones negros diseñados especialmente para eso. Grandes áreas de fondo oceánico son ricas en conchas calcáreas de Foraminíferos muertos. El "barro" de Globigerina, que cubre aproximadamente ciento treinta millones de kilómetros cuadrados del suelo del océano, está formado casi por completo de estas conchas. Se pueden secar y filtrar dragados procedentes de estas áreas, colocando los filtrados más finos en recipientes con agua que se procede a agitar. Las conchas más delicadas flotarán, pudiendo ser recogidas, mientras que las más pesadas se hunden y pueden secarse tras extraer el agua. Muchas especies de Radiolarios viven en, o cerca de, la superficie del mar, donde a veces son muy numerosas. Pueden recogerse mediante una red de arrastre o en un simple frasco de agua marina. Las conchas silíceas de los Radiolarios muertos caen al fondo y forman el "barro de los Radiolarios", que cubre un área de más de cinco millones de kilómetros cuadrados. Este depósito se encuentra típicamente en aguas muy profundas de las regiones tropicales de los Océanos Indico y Pacífico. Se pueden recoger de igual forma que los Foraminíferos, por dragado, y secarse de forma similar.

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Las muestras de protozoarios marinos se pueden fijar mezclándolas con alcohol isopropílico de 95%. Este alcohol se puede agregar al agua que contengan los protozoarios, siempre que su volumen sea reducido o los protozoarios se hayan concentrado dentro de un área pequeña. Al fijar muestras con Foraminíferos o Radiolarios, se puede agregar un poco de rosa de bengala (un gramo de colorante seco por un litro de agua destilada), para colorear los protoplasmas de los protozoarios vivos. Entre los talos de las algas marinas se encuentran algunos protozoarios que habitan estos sitios. Colecte las algas y lávelas en un frasco con agua del medio. Las redes y los tamices de mallas finas pueden utilizarse para concentrar los protozoarios en limitados volúmenes de agua. También se pueden matar y concentrar, agregando gota a gota a las muestras de protozoarios una cantidad pequeña de formol neutro al 3%, hasta que mueran los protozoarios y se depositen en el fondo. En seguida, el agua se decanta dejando sólo una pequeña cantidad del fondo junto con el material sedimentado. Este puede fijarse y dejarse en alcohol de 70%. En general para su conservación, los especímenes vivos deben colocarse primero en alcohol al 70 - 90 %. También pueden ponerse directamente en una solución de formol neutro al 3 - 5 %. Si se está recolectando especímenes para un posterior examen citológico, debe consultarse literatura especializada en técnicas de fijación.

FIJACION Entre los fijadores más recomendables están los de Schaudin, Goldschmidt, Boui y Guilson. El material fijado en estos líquidos se puede usar para elaborar preparaciones fijas. Los flagelados, como Euglena, se pueden fijar con el líquido de Noland, que produce la muerte instantánea del protozoario y permite la observación clara del flagelo. Para fijar y montar temporalmente algunos protozoarios, agregue una gota de una solución de verde de metilo en ácido acético al 1% a una gota de cultivo de protozoarios. Este colorante fija y tiñe de verde los núcleos. Los ciliados o flagelados cultivados también se pueden observar en montajes temporales siguiendo el método de Noland: Solución de Noland: - Solución saturada de fenol en agua destilada............................... 80 cc. - Formol al 40% (comercial)............ 20 cc. - Glicerol.......................................... 4 cc. - Violeta de genciana...................... 20 mg. Se debe mezclar el colorante con un poco de agua, antes de agregar los otros ingredientes. No debe quedar fenol en suspensión. Agregue a una gota del cultivo de protozoarios, una gota de la mezcla. Los cilios

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y flagelos se tiñen claramente. Este es un método útil para el estudio de ciliados que poseen cirros.

DIVISION SISTEMATICA* Reino Protista Subreino Protozoos Filo Sarcomastigóforos Subfilo Mastigóforos Clase Fitomastigóforos Clase Zoomastigóforos Subfilo Opalinados Subfilo Sarcodinos Superclase Rizópodos Clase Lobosos Clase Eumicetozoos Clase Filosos Clase Granulorreticulosos Superclase Actinópodos Clase Acantarios Clase Policistineos Clase Feodarios Clase Heliozoos Filo Labirintomorfos Filo Apicomplejos Clase Perkinsidos Clase Esporozoos Filo Mixozoos Filo Microsporidios Filo Ascetosporos Filo Cilióforos * HICKMAN; ROBERTS; LARSON. Principios Integrales de Zoología.

LOGROS DE APRENDIZAJE Al término de la Práctica el estudiante reconoce e identifica los principales protozoarios de vida libre de nuestra Región, así mismo, identifica las principales estructuras y características de los diversos grupos taxonómicos de protozoarios observados, haciendo uso de las diversas técnicas de colección, conservación, fijación y observación microscópica.

MATERIALES MATERIAL DE LABORATORIO:

COLORANTES VITALES:

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- Microscopio - Lámina porta-objetos - Laminillas cubre-objetos - Láminas escavadas - Vaselina - Algodón - Glicerina - Palillos de madera - Goteros y/o pipetas - Placas Petry - Frascos de vidrio de diverso tamaño

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- Pardo de Bismark - Rojo Congo - Verde Jano - Verde de metilo - Azul de metileno - Lugol - Rojo neutro

MATERIAL BIOLOGICO: - Muestras diversas de aguas con protozoarios. - Cultivos de protozoarios. - Láminas con preparaciones permanentes coloreadas y sin colorear de protozoarios de vida libre.

METODOLOGIA I. OBSERVACION DE PROTOZOARIOS DE VIDA LIBRE Con el material necesario y las muestras de agua con protozoos proceder según las técnicas de observación siguientes: 1. TECNICAS DE OBSERVACION: 1. 1.EXAMEN DIRECTO: Este examen permite la observación de los protozoos vivos, su morfología, locomoción, reacciones, etc., durante la observación se requiere de enfocar adecuadamente y diafragmar convenientemente. Con una lámina portaobjetos y una laminilla cubreobjetos proceda a preparar y montar una muestra de agua estancada o una gota de cultivo. Observar al microscopio con mayor y menor aumento. Si al observar la muestra se nota demasiada movilidad en los especímenes, agregue a la preparación unas fibras de algodón (puede también utilizarse gelatina, goma arábiga, glicerina, etc.) para que de esta manera se pueda realizar una mejor observación. Si la muestra es muy pobre, y contiene pocos individuos, se puede concentrar los protozoos, para el caso se utiliza la filtración rápida e incompleta a través de un paño (tela o papel filtro) el residuo de la filtración debe ser vaciado rápidamente en un recipiente adecuado, antes de que se complete la filtración; puede también utilizarse la centrifugación a bajas velocidades.

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1.2. OBSERVACION EN CAMARA HUMEDA: A fin de que la pequeña gota de líquido que se examina no se concentre o deseque durante la observación, no se recurre al sencillo sistema de poner la gota entre porta y cubre-objeto, sino que se la encierra en un pequeño recinto situado entre ellos, que permite, además, entretener la vida de los protozoos durante algún tiempo. Esto se consigue de tres modos diferentes: 1.2.1. Cámara de Gota Pendiente: Para esta técnica se requiere de un porta-objetos especial, en cuya parte central tiene una excavación o concavidad de poca profundidad (porta-objetos excavado o lámina excavada). En la laminilla cubre-objetos bien limpio proceda a colocar en cada ángulo un punto de vaselina, esta puede ser colocada con la ayuda de un palillo de madera (mondadientes o fósforo); en la parte central de la laminilla coloque una gota de las muestras de agua a observar, luego adhiera la lámina porta-objetos a la laminilla de manera tal que la excavación coincida con la gota del medio de cultivo; realizado esto invierta y observe al microscopio con menor y mayor aumento. De ser conveniente se puede sellar los bordes con vaselina. 1.2.2. Cámara Húmeda de Ranvier: Con la técnica de la gota pendiente, el espesor de la capa líquida que se examina no es uniforme; esto hace que la observación a grandes aumentos venga perturbada por los fenómenos de reflexión y refracción de los rayos luminosos al atravesar la parte inferior de la gota. Para obviar este inconveniente y conseguir una capa líquida de igual espesor, con sus superficies límites paralelas, se recurre a otros métodos, entre los cuales el más utilizado es el de Ranvier. La cámara de Ranvier consiste en un porta-objetos, de bastante grosor, que tiene excavado en su parte central un canal circular, rodeando una plataforma de unos 15 o 20 mm de diámetro y cuya superficie queda 0.1 mm más baja que el resto del porta. Depositando la gota que se quiere examinar sobre esta plataforma y tapando con un cubre-objeto, éste la extiende en una capa uniforme entre dos caras paralelas cayendo al canal circundante el exceso de líquido que hubiese, y quedando así una capa líquida de igual espesor entre cubre y la plataforma, y una pequeña cantidad de aire encerrada en el canal, suficiente para mantener algún tiempo la vida de los protozoos, aunque no lo bastante para que la preparación se seque. 1.2...