Practica No 3.2 Cultivo DE Linfocitos PDF

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Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo Instituto de Ciencias de la Salud Área Académica de Medicina Licenciatura en Médico Cirujano

LABORATORIO DE GENÉTICA PRACTICA NO. 4: CULTIVO DE LINFOCITOS

Catedrática:

Dra. Ana Hilda Figueroa G Gutiérrez utiérrez Presentan:

Barrios Pilicastro Erick Jair Fierro Chavarría José Rodolfo González Rodríguez Fernando Daniel López Calderón Marco André López Cruz Ángel José Martínez López Mauricio Pineda García Valeria Monserrat Tovar Fuentes Jecsán

Grado: 2º

Grupo: 1

CICLO ESCOLAR: ENERO - JUNIO 2021 FECHA DE ENTREGA: 16 DE FEBRERO DE 2021

MARCO TEÓRICO

Los linfocitos son células sanguíneas inmunológicas (leucocito agranular) que se encuentran circulando por todo el organismo a través de la sangre y defiendes de agentes patógenos principalmente de tipo viral. Son células que por sus características permiten su cultivo in vitro para estudiarlas, apartir de una muestra de sangre y en un medio de cultivo adecuado, con las condiciones adecuadas y con utilidades diversas. El cultivo de linfocitos es una técnica que puede ser utilizada para el estudio de los linfocitos y enfermedades hemáticas, para la observación de metafases, para la observación y estudio de cromosomas, entre muchas otras aplicaciones. La realización de esta técnica se requiere de un ambiente de esterilidad, por lo que puede usarse el método por calor seco de forma frecuente, lo que brinda un campo estéril en el lugar donde se está realizando la siembra de los linfocitos. Debido a que son células que normalmente no se reproducen in vitro, requieren un estímulo con un agente de acción mitogénica como la fitohemaglutinina que permite su reproducción en el cultivo. Además, se requieren de otros reactivos como la colchicina para poder observar las metafases. Se realiza a partir de una muestra de sangre, aproximadamente de 3 ml, de los cuales se utilizan solamente 0.5 ml, los cuales se siembran en un medio de cultivo especial (PB-Max, GIBCO, MEM, etc.) en un medio estéril, luego se añaden algunos reactivos como la fitohemaglutinina, dependiendo del uso que tenga el estudio. Posteriormente se coloca en una estufs bacteriológica a una temperatura de 37° C por un periodo de 72 hrs. Por lo regular se suele sembrar en tubos de ensayo con el medio de cultivo, o bien en otros recipientes especiales. Después del periodo de 72 hrs, el cultivo se saca y se agregan 2 gotas de colchicina (para el estudio de metafases) y se vuelve a introducir a la estufa bacteriológica a una temperatura de 37° C por 30 min. Por último, para su observación al microscopio, es necesario montar en un portaobjetos previamente esterilizado en la llama, se colocan alrededor de 3 gotas del cultivo y se deja secar con la temperatura ambiente, después se tiñe con colorante Giemsa para observarlo al microscopio. El cultivo de linfocitos tiene aplicaciones importantes en el campo de la genética, sobre todo en la observación de cromosomas y metafases. CUESTIONARIO 1. ¿Qué es la fitohemaglutinina y de donde se extrae? La fitohemaglutinina (PHA) es un agente mitogénico que se ha utilizado en estudios sobre la permeabilidad de las células. La fitohemaglutinina (PHA), un derivado de

extractos de las semillas de Phaseolus vulgaris, se ha utilizado durante muchos años debido a sus propiedades, ya que causa la aglutinación de los eritrocitos y estimula la mitosis progresiva de los linfocitos en cultivos celulares. Tanto la actividad de aglutinación como la mitogénica están aparentemente asociadas con las fracciones de proteínas de extractos crudos y sus propiedades fisicoquímicas se parecen lo suficiente como para dificultar la separación de ambas. Otro factor que dificulta los procedimientos de fraccionamiento es el método utilizado (lento e impreciso) para el análisis de la actividad mitogénica. 2. ¿Cuál es la función de la fitohemaglutinina en el cultivo de linfocitos? •La fitohemaglutinina (PHA) del Phaseolus vulgaris aglutina hematíes y leucocitos; es capaz de unirse a oligosacáridos y estimula la mitosis en diferentes estirpes celulares, incluidos los linfocitos. •Se ha demostrado que la PHA es importante en el estudio de la respuesta inmunitaria, la cinética de los linfocitos y la dinámica de la médula ósea. Para estos fines, es más adecuado utilizar una sustancia cuyas cualidades sean fáciles de reproducir y cuya potencia sea conocida. 3. ¿Qué es la colchicina? Fármaco antimitótico que detiene o inhibe la división celular en metafase, y permite la realización del cariotipo. Es un compuesto que evita la distribución de las cromátidas de un cromosoma durante la mitosis, provocando la poliploidía de la célula filial, ya que aunque no haya separación, sí hubo duplicación previa del material genético. Su efecto se debe a su acción sobre las proteínas citoesqueléticas del huso mitótico denominadas tubulinas. Al desorganizarse el huso, los cinetocoros de las cromátidas no tienen donde unirse y traccionar, ocasionando que los cromosomas no se distribuyan normalmente durante la división celular. De este modo, en presencia de colchicina la división celular se interrumpe o bien da origen a células que son inviables debido a su carga cromosómica anómala. 4. ¿Cuál es la función de la colchicina en el cultivo de linfocitos? Evitar la polimerización del huso mitótico y posterior a esto detiene la división celular en los linfocitos cultivados. 5. ¿Qué aplicaciones tiene un cultivo de linfocitos? En un medio libre de suero listo para usar, idóneo para el cultivo de células mieloides y linfoides de sangre periférica o médula ósea, resulta muy útil para la investigación de enfermedades leucémicas gracias a su posterior análisis mediante ensayos y exámenes citológicos. ANÁLISIS DE MUESTRAS HISTOLÓGICAS

El intercambio de cromátidas hermanas (SCE) es un fenómeno natural, que ocurre con frecuencia en la multiplicación de células somáticas y de la línea germinal , y se ha observado en diferentes líneas celulares, en mamíferos y otras células animales y vegetales, tanto in vitro como in vivo . Los SCE representan los intercambios recíprocos de segmentos de ADN entre cromátidas hermanas de un cromosoma en loci homólogos. Se pueden clasificar en SCE espontáneas (observadas en células normales) y SCE inducidas (observadas en células cancerosas y células tratadas normales). Este fenómeno tiene lugar durante la fase sintética (S) del ciclo celular. Lo que vemos en la imagen son cromosomas en anillo, por lo general, los cromosomas parecen cuerdas largas cuando se las examina bajo el microscopio. A veces, uno de los cromosomas se reordena en forma de anillo. Esto se llama “cromosoma en anillo”. Un cromosoma en anillo se forma cuando el extremo de los brazos de uno de los cromosomas se une con el extremo de otro brazo. Cuando se forma el anillo, el extremo del brazo largo y el extremo del brazo corto del cromosoma no se encuentran presentes. Aunque infrecuente, este tipo de alteración citogenética se ha descrito en cada cromosoma humano. Las características clínicas observadas en esta alteración varían dependiendo del número y función de los genes que presentan deleción, duplicación y la estabilidad del anillo.

En esta imagen podemos observar un juego de cromosomas en metafase sometidos a coloración mediante tinción de Giemsa. Se distingue con nitidez cada cromosoma compuesto por 2 cromátides unidas por el centrómero.

En esta imagen podemos observar el intercambio de cromátidas, que es el intercambio de material genético entre dos cromátidas hermanas idénticas. Son simétricos entre dos segmentos idénticos. Este tipo de tinciones es especialmente útil para reconocer la inestabilidad cromosómica en distintos síndromes y para carcinógenos y mutágenos. Tinción diferencial de Fluorescencia más Giemsa.

LISTA DE COTEJO Lista de cotejo para reporte de práctica El reporte tiene todos los apartados Sí solicitados 2 puntos La información es clara y coherente con el Sí tema 2 puntos La información es de autoría propia y Sí enriquecida mediante investigación, 2 puntos anexando referencias Las respuestas del cuestionario son Sí adecuadas y suficientes para cada 2 puntos cuestionamiento El reporte se elaboró y entregó en el Sí periodo establecido 2 puntos Total

No 0 puntos No 0 puntos No 0 puntos No 0 puntos No 0 puntos

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Silva E, Crane C, Bermúdez AJ, Bueno ML, Pedraza X, Giraldo A. Citogenética Humana: Manual de procedimientos. INS. Disponible en: https://www.minsalud.gov.co/sites/rid/Lists/BibliotecaDigital/RIDE/IA/INS/citogen etica-humana.pdf 2. Ozsu E, Yeşiltepe Mutlu G, Ipekçi B. Ring chromosome 13 and ambiguous genitalia. J Clin Res Pediatr Endocrinol. 2014; 6: 122-4. 3. Finn Genesser. (2015). Histologia. Madrid España: Panamericana. 4. Gil M. Rojo de fenol: características, preparación, aplicaciones [Internet]. Lifeder. 2021 [Citado 9 Feb 2021]. Disponible en: https://www.lifeder.com/rojo- fenol/ 5. Gutiérrez S. Métodos de esterilización. UCV. [Citado el 9 de Feb de 2021]. Disponible en: http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_M %C3%A9todos_de_esterilizaci%C3%B3n.pdf 6. IBIAN TECHNOLOGIES. Citogenética [Internet]. ibiantech.com [Citado 9 Feb 2021]. Disponible en: https://www.ibiantech.com/citogenetica/#:~:text=Es%20un%20medio%20libre% 20de,mediante%20ensayos%20y%20ex%C3%A1menes%20citol%C3%B3gico s. 7. López Diaz Z, García Tarrau M. Tema 7: Métodos de Esterilización. | UVS Fajardo [Internet]. Uvsfajardo.sld.cu. 2013 [Citado 9 Feb 2021]. Disponible en: http://uvsfajardo.sld.cu/tema-7-metodos-de -esterilizacion 8. TRABAJO PRÁCTICO: MITOSIS y CITOGENÉTICA HUMANA [Internet]. Disponible en: http://www.ege.fcen.uba.ar/wp-content/uploads/2019/05/Guia1erTP-Citogen-%C2%AEtica-1C2019.pdf...