Prácticas del laboratorio de bioquímica 1. PRACTICA 3 PDF

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Este reporte describe lo realizado en el laboratorio de bioquímica 1. Es útil para realizar comparaciones de resultados, aclarar la idea de la práctica, asi como parafrasear metodologías. Todos los reportes fueron viguramente revisados y no contienen errores en cuanto a resultados e ideas descritas ...

Description

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Instituto de Ciencias Biomédicas, Programa de Licenciatura en Química. Laboratorio de Bioquímica 1. Práctica 3. Espectrofotometría. Susana Helena Arellano Ramírez 154883, Jonathan Josué Calvillo Solís 154790, Cynthia Elizabeth Téllez Cruz 154851, Erick Isaac Rico Carrillo 166231. A-L1 INTRODUCCIÓN El método de análisis cuantitativo denominado espectrofotometría, se basa en la capacidad de las sustancias de absorber o emitir luz (radiación electromagnética) a una longitud de onda determinada, en proporción directa a la cantidad de materia presente. Mediante el espectrofotómetro se obtiene una medida del valor de la absorbancia de una muestra (Watton, F. y Reyes, J. 2005). La espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible (UV-VIS) fue uno de los primeros métodos físicos que se aplicó al análisis cuantitativo, sin embargo la escasa información cualitativa que proporciona impide la resolución simultanea de manera sencilla de mezclas de componentes con espectros traslapados. Los espectrofotómetros se componen de 5 partes básicas: fuente de radiación electromagnética, un selector de longitud de onda, zona de muestra, detector y procesador. Las fuentes más empleadas son las lámparas de tungsteno para la región visible. Cuando el instrumento cuenta con un monocromador como selector de longitud de onda se denomina espectrofotómetro, y cuando es un filtro, fotómetro. La zona se muestra es una de las piezas más importantes, debido a que puede contribuir a la toma de erróneas mediciones, es por eso que las celdillas son de cristal o de cuarzo, materiales que no se rayan, evitando la dispersión de la luz que incide en la muestra. Los detectores más utilizados son los transistores, que transforman la absorbancia o transmitancia en una señal eléctrica, la cual es interpretada con un proceso (Pino, P. y Pérez, B. 1983). Absorciometría es el término comúnmente empleado en la medida de la radiación absorbida. Sin embargo, el término espectrofotometría se usa comúnmente cuando la radiación se extiende a las regiones ultravioleta e infrarroja y se usan monocromadores en lugar de filtros como lo es en el caso de la colorimetría y en la cual se trabaja en la región visible del espectro electromagnético. Cuando un haz de radiación monocromática de una determinada longitud de onda atraviesa una capa de disolución conteniendo una especie absorbente, la potencia (energía por unidad de tiempo y unidad de área) del haz incidente P ₀ se atenúa, disminuyendo hasta P. Se define la transmitancia (T) como la fracción de radiación incidente que consigue atravesar la muestra. Varía de 0 a 1 y puede expresarse también como porcentaje (Hernández, L. y Claudio, G. 2002). Al incidir una haz de luz de determinada longitud de onda sobre una muestra, parte de esta luz es absorbida y la otra es reflejada o transmitida. La cantidad de luz absorbida por la muestra es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del ancho de la celda. Es importante hacer mención del coeficiente de extinción molar (ε), el cual es constante para cada sustancia, de lo cual se establece la ley de Beer-Lambert, esta ley se cumple en cierto rango de concentración por lo que se debe de validar con una curva de calibración (Quesada, M. 2007). Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dialéctica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas (Skoog, D. 2015).

OBJETIVO  Aprender el uso del espectrofotómetro para determinar los espectros de absorción y curvas de calibración de 2 sustancias coloridas: safranina y verde brillante. METODOLOGÍA Se utilizó un espectrofotómetro UV – VIS modelo VE-5600 y una celdilla de vidrio Glass Cuvette con un grosor de celda de 10 mm y una capacidad de 2 mL.

a) Determinación del máximo absorción de los colorantes.

VERDE BRILLANTE. En la siguiente tabla (Tabla 1) se muestran las absorbancias registradas a determinadas longitudes de onda, de una muestra de verde brillante 4.41 x 10-5 M. Longitud de onda (nm) 450 480 510 540 570 600 630 660 690

Experimento 1. Máximo de absorción. Tomar una celdilla y agregar 1.5 mL

Registrar la absorbancia en intervalos de 30

Calibrar a 0 absorbancia.

Tomar una celdilla y agregar 1.5 mL d f i

de

Absorbancia 0.108 0.007 0.041 0.157 0.483 0.996 1.594 0.391 0.041

Tabla 1. Absorbancias a diferentes longitudes de onda, de una solución de verde brillante 4.14 x 10-5 M.

La figura 1 muestra el comportamiento de las absorbancias a diferentes longitudes de onda, donde se observa un comportamiento gaussiano. El máximo de absorción se registró a 630 nm.

Experimento 2. Curvas de calibración.

1.8 1.6 1.4

Proporción: 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16

1.2

Absorbancia

Preparar diluciones de safranina y verde brillante.

1.0 0.8 0.6 0.4

Registrar la absorbancia en el máximo de absorción determinado anteriormente. RESULTA

0.2

Calibrar a 0 absorbancia.

0.0 -0.2 450

500

550

600

650

700

Longitud de onda (nm)

Tomar una celdilla y agregar 1 5 mL de

Figura 1. Máximo de absorción de una solución de -5 Enverde brillante 4.14 x 10 M.

registradas a determinadas longitudes de onda, de una muestra de safranina 7.12 x 10-5 M.

0.0625 Longitud de onda (nm) 450 480 510 540 570 600 30

Absorbancia 0.365 0.867 1.458 0.008 0.155 0.011 0

0.045

Tabla 3. Absorbancias a diferentes proporciones de verde brillante/agua, obtenidas a ʎ = 630 nm.

En análisis por regresión lineal se muestra en la figura 3, donde se obtuvo un R2= 0.995, la ecuación de la recta correspondiente es y = 2.0914x – 0.0891. 1.0

Equation

y =a +b*x

Adj. R-Squa 0.99499 Value

Tabla 2. Absorbancias a diferentes longitudes de onda, de una solución de safranina 7.12 x 10-5 M.

Absorbancia

La figura 2 muestra el comportamiento de las absorbancias a diferentes longitudes de onda, se observa también un comportamiento gaussiano. El máximo de absorción se registró a 510 nm.

0.8

B B

Intercept -0.0891 Slope 2.0914

0.02467 0.08562

0.6 0.4 0.2 0.0

1.6 1.4

0.0

0.1

1.2

Absorbancia

Standard Err

0.2

0.3

0.4

0.5

Agua/verde brillante Figura 3. Curva de calibración de verde brillante obtenida a ʎ = 630 nm.

1.0 0.8 0.6

SAFRANINA Las absorbancias obtenidas al medir disoluciones a diferentes proporciones safranina/agua, se muestran en la tabla 4.

0.4 0.2 0.0 -0.2 450

480

510

540

570

600

Proporción de la disolución (safranina/agua) 0.5 0.25 0.125 0.0625

630

Longitud de onda (nm) Figura 2. Máximo de absorción de una solución de safranina 7.12 x 10-5 M.

0.968 0.413 0.154 0.069

Tabla 4. Absorbancias a diferentes proporciones

Ede safranina/agua, obtenidas a ʎ = 510 nm. en la un 0.6 Value Standard Erro R2= 0.997, laInterceptecuación de la recta B -0.0436 0.01233 B Slope 1.35638 0.0428 0.5 correspondiente es y = 1.3563x – 0.0436. Absorbancia

b) Construcción curvas de calibración. VERDE BRILLANTE. Las absorbancias obtenidas al medir disoluciones a diferentes proporciones de verde brillante/agua, se muestran a continuación (Tabla 3). Proporción de la disolución Absorbancia (verde brillante/agua) 0.5 0.641 0.25 0.278 0.125 0.133

Absorbancia

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Figura 4. Curva de calibración de safranina obtenida a ʎ = 510 nm.

c) Determinación de la concentración de una muestra problema de verde brillante. Con la respectiva longitud de onda en que se obtuvo la máxima absorbancia de la solución de verde brillante (510 nm), se midió la absorbancia de una muestra de verde brillante de concentración desconocida, la cual tuvo un valor de 0.433. Mediante la curva de calibración (figura 4), se determinó la concentración de la disolución. Ecuación 1.

y =2.0914 x −0.0891 Dónde: y: Absorbancia x: Proporción verde brillante/agua.

De la ecuación de la recta, se despeja x. x=

y+ 0.0891 2.0914

Chouber, R. en 2013, reportan que los máximos de absorción del verde brillante es de 625 nm y safranina de 520 nm. Realizando una comparación, es posible afirmar que las longitudes de onda son correctas, ya que no existe una diferencia significativa entre lo reportado y lo obtenido experimentalmente. Dichas variaciónes se deben a que los intervalos de medición son muy grandes, es decir, al realizar mediciones cada 30 nm no es posible establecer un valor exacto, por lo tanto, si se desea determinar el máximo de absorción de cualquier molécula con mayor exactitud, es necesario realizar mediciones en intervalos de longitud de onda cortos (1 – 5 nm), aunque esto signifique una mayor inversión de tiempo. La curva de calibración de las disoluciones de safranina obtuvo un valor de R2 = 0.995, y una ecuación de la recta y = 1.3563x - 0.0436. Debido a que el coeficiente de variación es muy cercano a 1, los valores de absorbancia registrados son correctos. En el caso de la solución de verde brillante, se obtuvo un valor de R 2=0.997, y una ecuación de la recta de y = 2.0914x – 0.0891, ecuación que fue utilizada para determinar la concentración de una muestra problema en base a su absorbancia, en este caso de 0.433, la cual resultó ser una disolución 1:4.

Ecuación 2.

Donde x tuvo un valor de 0.2496, por lo cual se trata de una disolución con una proporción 1:4. DISCUSIÓN Los máximos de absorción obtenidos para la safranina y verde brillante fueron 510 nm y 630 nm respectivamente. Estudios realizados para el análisis de las propiedades ópticas con láser de algunos colorantes de importancia biológica por Medhekar, S., Kumar, R., Mukherjee, S. y

CONCLUSIÓN Los máximos de absorción obtenidos experimentalmente fueron correctos, ya que al realizar una comparación con lo reportado la variación fue mínima. Al realizar las curvas de calibración en base a las diluciones de safranina y verde brillante, se obtuvieron coeficientes de determinación cercanos a 1, con lo cual se validó la ley de Beer-Lambert para este procedimiento. Se comprobó que los datos obtenidos de absorbancia a determinadas concentraciones estaban correlaciados, con lo cual fue posible encontrar la concentración de una muestra

problema. Esto muestra que la espectrofotometría es un procedimiento práctico y sencillo para la determinación de la concentración de una sustancia que absorbe radiación electromagnética en el espectro UV-VIS. BIBLIOGRAFÍA Hernández, L. & Claudio, G. (2002). Introducción al análisis instrumental. España, Barcelona: Editorial Ariel. p. 320-321. Medhekar, S., Kumar, R., Mukherjee, S. y Chouber, R. (2013). Study of Nonlinear Refraction of Organic Dye by Z-scan Technique Using He-Ne Laser. American Institute of Physics. 1512(470-471). Pino, P. & Pérez, B. (1983). Análisis de elementos traza por espectrofotometría de absorción molecular UV-VIS. España, Córdoba: Editorial Publicaciones de la Universidad de Sevilla y monte de piedad y caja de ahorros de Córdoba. p. 123-125. Quesada, M. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Costa Rica, San Jose: Editorial Universidad Estatal a Distancia. p. 24-30. Skoog, D. (2015). Fundamentos de química analítica. México, D. F.: Editorial Cengage Learning. p. 421-425. Watton, F. & Reyes, J. (2005). Nuevos métodos fotométricos y cromatograficos para la determinación de colorantes rojos en alimentos. España, Córdoba: Ediciones de la Universidad de Castilla-La Mancha. p. 77-80....