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PRÁCTICAS TISSUE ENGINEERING CELLS - SCAFFOLDS BIOCOMPATIBILITY  Colágeno  PHB  PCL  SEDA-SILK  PLA  PA (COL: Colageno-I, PHB: Poly-Hidroxi-Butirato, PCL: poly-e-Caprolactona, Seda, PLA: poly-Lactic Acid, PA: Polyamida) Modelo de DM Tipo 1A Descripción del modelo NOD:  Non-obese diabetic  Modelo que mejor refleja los mecanismos de patogénesis de la DM1A en el humano Desarrollo de enfermedades autoinmunes de manera espontánea. Desarrollo de la enfermedad en el ratón NOD:  Peri-insulitis: 3-4 semanas  Insulitis severa: 10 semanas  Primeros síntomas de diabetes: 12-14 semanas en las hembras y ligeramente más tarde en los machos  Incidencia de desarrollo de diabetes del 60-80% en hembras y 20-30% en machos Diabetes Animal Models

ATHEROSCLEROSIS MOUSE MODEL

*ApoE: Apolipoproteína esencial para el catabolismos de las LP ricas en TG Su falta de expresión provoca aumento de colesterol en sangre) ORTHOPEDIA RELATED DISEASES /CARDIAC AND VASCULAR DISEASE/ NEUROLOGICAL DISORDERS SURGICAL METHODS TO INDUCE DISEASE, FUNCTIONAL AND HISTOLOGICAL ANALYSIS OTHER BRAIN DISEASE MODELS • Modelos animales de enfemedades cerebrales: Amnesia, Ansiedad, Depresión, Esquizofrenia Medios: lesiones, tratamiento con fármacos, manipulaciones genéticas • Modelos animales de conducta: Animales son entrenados para expresar una conducta específica comparable a la humana (test de aprendizaje y memoria) TEST DE CONDUCTA: Aprendizaje y Memoria T-maze: Los animales deben aprender a alternar entre los dos brazos del laberinto.  Fase de muestra: acceso 1 brazo con pellet de comida  Fase de elección: libre acceso a dos brazos Radial-arm maze: memoria de trabajo. - Necesidad de pistas en las paredes (posición relativa de los objetos) WATER MAZE: MEMORIA A CORTO Y LARGO PLAZO Es un test de memoria espacial. Los animales son entrenados para que encuentren una plataforma escondida a la vista. El tiempo de latencia en encontrar es el parámetro mas importante de esta prueba. 1) Fase de aprendizaje 2) Fase de retención Ansiedad: Laberinto elevado y Laberinto Zero El laberinto elevado (Pellow, 1985) y el laberinto cero (Shepherd, 1994) fueron diseñados para medir la ansiedad. Ambos basados la aversión natural de los animales hacia los espacios abiertos. Los animales pasarán más tiempo en los brazos cerrados y el tiempo de latencia para la primera visita a un brazo abierto es también mucho mayor. Aplicaciones: Screening de fármacos ansiolíticos y fenotipaje genético Cajas de Skinner (1935): Cámara cuadrada en donde hay una palanca que cuando se presiona libera una cucharada de comida. El animal aprende la relación existente entre presión de la palanca y comida disponible. La frecuencia con la cual el animal presiona la palanca aumenta con el tiempo hasta llegar a un máximo.

FUENTES DE CELULAS MADRE

Hay distintos tipos de de células madre: embrionarias, iPS, pluripotentes y adultas multipotentes Las embrionarias se obtienen del blastocisto y son células que se pueden mantener en cultivo y se caracterizan por capacidad de proliferación ilimitada, diferencian a células somáticas y germinales (a todo tipo de tejidos) y pueden formar tumores y ser inmunogenicas. Las células adultas se obtienen de cada tejido adulto, la capacidad de proliferación y división es limitada, son controladas no forman teratomas y permiten realizar trasplantes autologos, sin rechazo. Células madre adultas multipotentes •Blood: HSC, EPC •Bone Marrow: HSC, EPC, MAPC, MSC •Adipose Tissue: SVF, ADSC •UCB: HSC, MSC, USSC •Neural SC •Muscle and Heart SC: SkMb, SatC, CSC… Dentro de las cel.mdre plrutipotentes: Se obtienen de la sangre , medula tejido adiposo, cordón umbilical, principalmente. Incluso tejido en los que s creían que no había como cerebro y corazón también se han identificado. CELULAS SANGUINEAS: Célula madre hematopoyéticas: Dan lugar a los distintos linajes sanguíneos progenitores vasculares o endoteliales (forman nuevos vasos en los tejidos) Para aislar distintas poblaciones sanguíneas a partir de la sangre: hacemos un gradiente de FICOL (polisacárido con una densidad). Ponemos la sangre sobre el ficol, centrifugamos y nos permite separar distintos tipos de células. Precipitan eritrocitos y células NK y queda el PBL arriba con monocitos y linfocitos. Separa las células mononucledas del resto de células e inyectar directamente o diferenciarlas a otro tipo de células Lo mismo que se hace con la sangre se pueden obtener de la medula a partir de distintos progenitores hematopoyéticos, cel estromales de las que derivamos las células mesenquimales y también están las células epiteliales no hematopoyéticas. Es muy importante conocer los marcadores que expresan cada tipo celular dentro de la medula osea:  Cd45 y CD34 hematopoyéticas de la sangre y de la medula.  No expresan CD34 pero si CD133las progenitoras endoteliales no hematopoyéticas (progenitores vasculares).  No CD45, no CD31 y si expresan otros marcadores como el CD44 o el CD90 y CD166las mesénquimales

En un paciente se aspira la médula peor en un animal se extraen los huesos y de ahí se extrae la medula. Después con la medula del hueso siempre quedan células muy adheridas se trata con colágenasa y se corta en trozos para disgregarlo ye extraer las células que están íntimamente pegadas. Técnica rápida que permite obtener gran cantidad de cel que si ponemos en cultivo da lugar a mesenquimales. Sino contendría todos los progenitores hematopoyéticas que están en la medula

COMO SE CARACTERIZAN LAS CELULAS MADRE: FENOTIPO 1. CITOMETRO DE FLUJO: la técnica mas habitual. Marcas las células con ac que detectan las moléculas que expresan y las puedo fenotipar por citometría y las puedo sortear. Hago un sorteo mediante citometria de forma que ,arco mis células y aquellas que están marcados positivamente y expresan un fluorocromo concreto adquieren carga negativa y cuando pasan por el aparato queden separadas de las que no están cargadas  Tissue/Blood isolated (selected by specific markers or isolation methods): -HSC (blood/BM) (CD34+ CD45+)celulas madre hematopoyeticas -EPC (blood/BM) (CD34- CD133+)celulas progenitoras endoteliales  After in vitro culture (selected by cell culture): -BOECs (Blood) (CD45- CD31+ CD146+ CD309+) -Mesenchymal cells (CD45- CD31- CD44+ CD29+ CD70+ CD105+) 2. Sistema de marcar células para sortearlas, pero en vez de utilizar AC, los marcadores pueden llevar partículas o bolas de hierro. Marco las células que expresan un marcador concreto con ac con bola magnéticas, las pudo pasar por un tubo de forma que si pongo unos imanes las células que lleven partículas magnéticas puedo separarlas y distinguirlas del resto. 3. AISLAR MEDIANTE CULTIVO: Podemos seleccionar las células frescas o podemos producir otro tipo de poblaciones mediante su cultivo. Esto pasa con las células mesenquimales que se obtienen recogiendo las células mononucleadas de la medula o de otros tejidos y poniéndolas en cultivo, al pasar dos o tres semanas tenemos una población pura de mesenquimales. Sin embargo, va estar contaminadas con otras poblaciones pero pongo un medio que favorezca el crecimiento las estromales y no las otras

BOECs (Blood outgrowth endothelial cells)  

Isolation of PBLs from Blood (ficoll ) and culture until colonies appear Endothelial Media: Basal media + 10% FBS + Suplements (Heparin,VEGF, R3IGF, HGFb, HydroCortisone, Ascorbic acid)

Las células BOECs, son también progenitores vasculares en la sangre y en la medula que puedo aislar por marcadores o bien mediante su cultivo. En el caso de las cel endoteliales pongo un medo de cultivo que favorezca su crecimiento. El medio es clave. En este caso, hago un FICOL a partir de la sangre donde separo todas las células mononucleadas y lo pongo en cultivo con un medio con suero y suplementos que favorecen el crecimiento de células endoteliales (IGF, VGF, heparina, citoquinas…). Después de caracterizan por cartometría; las boecs no expresan CD45 ni CD14 y si expresan CD31 (100%). Expresan otros como CD146 (100%), CD309 (99%), CD34 (38%). CELULAS MADRE MESENQUIMALES En el caso de las mesenquimales también se pueden obtener a partir del estroma de muchos tejidos lo mas habitual es la medula y tejido adiposo porque son tejidos mas accesibles. BM-MSC isolation and culture: • Isolation: - Clean bones and crush gently in a morter - Remove buffer (keep it) - Treat bones with Collagenase-I (45min) - Filter bones and media, centrifuge and culture (2.5 x 106 cells/cm2) • Cell culture: - Standard media: DMEM + 10% FBS (+ 1-5ng/ml bFGF) - Split every 3-4 days at a ratio 1:3-1:4 Las células mesenquimales las vamos a cultivar y diferenciar a distintos tipos celulares: Adiposo, cartílago, hueso. Para aislar en el hueso , trituramos el hueso y extraemos las células en un medio de cultivo DMEM con suero bobino fetal y se añade bFGF básico una citoquina que favorece que crezcan de forma mas rápida. Las celulas se tripsinizan y cuando alcanzan confluencia se pasan de un frasco a otro. Cuando extraemos la médula y la ponemos en cultivo vemos que empiezan a formar colonias que ocupan todo el cultivo hasta que forman una monocapa . MEDIOS DEPENDIENDO DEL TIPO CELULAR:  DMEM/RPMIÇ/F1C12..: habituales para cultivo celular. El RPMI para células en suspensión que no se adhieren y el DMEM para células que si que se adhieren al frasco de cultivo (NO hematopoyéticas). El medio contiene sales, Aa…

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Se coge el feto para el suero bobino porque el nivel de AC que tienen los fetos es menor que los adultos y la concentración de FT presentes en el suero de animales fetales es mucho mayor. Añadimos siempre antibióticos (penicilina , streptomicina y glutamina como fuente de energía) según el tipo de células que cultivamos añadimos citoquinas que favorecen el crecimiento de las células en concreto.

FENOTIPO DE CELULAS MSENQUIMALES: No son hematopoyéticas (no CD45) ni endoteliales CD34 ni CD31 y expresan: CD73, CD105 , CD44, CD13 y CD90. Expresan el complejo de histocompatibilidad 1 (MHC-I) pero no el 2, por lo que las mensenquimales son inmunomoduladoras DIFERENCIACION Adipogenic Differentiation: - Culture ADSC cells in basal medium until 95-100% confluence is reached. - Wash cells with PBS and add the adipogenic differentiation medium. - Change medium every 3 days -Maintain 3 weeks in culture in differentiation medium. Chondrogenic Differentiation: - Trypsinize and count cells. - Centrifuge ADSC cells (2 x 105 cells) to form a pelleted micromass. - Culture pellets in 15 ml conical tubes with chondrogenic medium. - Change medium every 3 days, avoiding removing pellets.- Maintain 3 weeks in culture in chondrogenic differentiation medium. Osteogenic Differentiation: - Trypsinize cells and plate 5 x 103 cells/cm2 in ADSC medium. - One day after, change medium to osteogenic differentiation medium. Change medium every 3 days. - Maintain cells 3 weeks in culture with the osteogenic differentiation medium. Que confluencia tienen, que medios estamos añadiendo y como están dispuestas estas células si en 2D o en 3D. En el caso que fuéramos a diferenciar las células mesenquimales a adipocitos tenemos que ponerlas en medio confluentes y añadiendo medios de cultivo hasta que diferencien hasta adipocitos en 2-3 semanas para que están 100%. Si queremos diferenciar hacia hueso las células tienen que estar sembradas a una densidad muy baja confluencia, utilizando un medio de cultivo diferente Para diferenciar a cartílago es importante que las células se dispongan en 3D, podemos formar un pellet tripsinar las células centrifugarlas y el pellet que queda de células tal cual diferenciarlas sin disgregarlas sobre el pellet. 

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En todos los casos lleva unas 2-3 semanas diferenciar las células. En el caso del hueso utilizamos distintos factores: TABLA Para la grasa: insulina y BMX Para cartílago: ITS, TGF-betta

Para saber si pasadas las 2-3 semanas han diferenciado:

En la diferenciación adipogenica es la tinción de Oil-red O staining, es un colorante que va marcar los lípidos de rojo. Es importante incluir controles, si hacemos el mismo protocolo con fibroblastos no se diferenciaran hacia adipocitos y no se teñirán de rojo. En el caso del hueso fijamos las célula con formalina y añadimos el colorante rojo como el Alizarin red-S staining. También utilizamos la prueba de la alcalina fosfatasa. No, Todas las células que expresen alcalina fosfatasa son células madre, sin embargo, las que diferencian a hueso si que expresan por eso añadimos el reactivo que precipite por alcanina fosfatasa y de la coloración azul. Esta técnica por si solo no me servirá porque no se si tengo células madre aun o células diferenciadas. En el cao del cartílago utilizo los pellets de células los seco los disecciono con el micrótomo y puedo teñir con el azul de toluidina. CELULAS MESENQUIMALES DE HUESO Y DE GRASA: Adipose-derived Stem Cells (ADSC) Cogemos la grasa y la tenemos que procesar para separar la cel etromales de las adiposas, y con la grasa la tratamos mecánicamente (trozeandola) con la colágenas que va disgregar las células ayudado a romper la matriz del tejido adiposo y por centrifugación puedo separar distintos tipos de células. Los adipocitos quedan en la parte superior por tener mucha grasa. Queda un pellet de células que es la fraccion estromal vascular (de distintas poblaciones de progenitores), para obtener las mesenquimales pongo estas en cultivo y elimino otros tipos celulares. Si las queremos caracterizar expresan los mismos marcadores que las mesenquimales de medulas.

MIOBLASTOS ESQUELETICOS Sk Mb isolation and culture: • Isolation: - Mechanic digestion (1-2 mm3 pieces) - Gentle centrifugation to wash sample - Collagenase-I + Tripsine substitute (37C shacking) - Filter and culture cells - CONTROLS: Viability, microorganisms… • Cell culture: - DMEM/F12 + 15% FBS+ 5ng/ml bFGF - Split every 3-4 days at a ratio 1:3-1:4 Biopsias de musculo. Con tratamiento en el corazón. Son resistentes a la hipoxia porque vienen del muslo y van a sobrevivir mas en el tejido. Pero no es la fuente celular de lección en la mayoría de casos.

Se tritura el tejido para seleccionar células cd56+ que nos van a pode permitir aislarlas del resto de células presentes en la biopsia. Digestión mecánica disgrega bien el tejido para que la enzima pueda actuar y ayudar a separar bien las células de la matriz y de las uniones que existen entre ellas. Y después marcarlas o por cultivo podamos purificar al células. En el caso del GMP se utilizan sustitutos de cultivos animales cuando las células ya están confluentes se utiliza la tripsina de origen animal. En este caso, se utilizan sustitutos químicos que permiten disgregar las células sin la necesidad de algo de origen animal. En el cultivo utilizamos DMEM y se juega con la concentración de suero. bFGF al principio mucha cantidad para ayudar a que las células proliferen y una vez que están en marcha tripsinizarlas cada 3-4 días para que no entren en senescencia. BIOREACTORES Cuando queremos situaciones concretas, en casos de empresa en las que se producen células par implantar en pacientes permiten controlar las condiciones de cultivo de las células y dependiendo del tipo de bioreactos expandirlas en grandes cantidades, sin utilizar tantos frascos de cultivo. Nos ayudan a controlar las condiciones de oxigeno, presión, tª, el flujo del cultivo.. Hay de múltiples tamaños de hasta 50L donde cultivamos las células. CONDICIONES FISICOQUIMICAS: 1. PH: necesitamos que se adecuado para las células, ni muy básico ni muy acido cuando están en confluencia alta producen lactato acidifican el medio y es importante que el bioreactor permite que las células tenga un medio neutro para el crecimiento 1. Tª: 37 Gradso para mantenerlas en cultivo ideal 2. OSMOLARIDAD: afecta ala viabilidad y a como proliferan de rápido despacio nuestras células. 3. OXIGENO: en los incubadores normales utilizan un 20% de oxigeno del ambiente sin embargo en el cuerpo humano están al 5% de oxigeno. Simula las condiciones decla medula 4. FLUJO DEL MEDIO: mantienen las células en suspensión para que no se agreguen. Controla que no sea muy fuerte el flujo para que no sea agresiva para las células, y en las células que en el organismo estan en contacto con el flujo sanguíneo o vasos reaccionan a ese flujo y es importante controlarlo. CONDICIONES BIOQUIMICAS: 1. Nutrientes: glucosa y glutamina siempre presente como fuente de energía 2. productos metabólicos: de las propias células, es importante controlarlos para que no sea toxico e induzca la apoptosis 3. citoquinas: agregar F de crecimiento que favorezcan ese cultivo a una concentración determinada.

TIPOS DE BIOREACTORES 1. ROLLER BOTTLES: La superficie es rugosa, con lo cual tienen la ventaja de aumentar la superficie de contacto que tenemos y crecen un numero de células mucho mayor. Para células adherentes. Las botellas rodantes son muy baratas, muy versátiles, peor el control es mas limitado. Solo sirve para células adherentes. 2. STIRRED BIOREACTORES: un molino que mantiene el flujo y hace que las células en suspensión se encuentran en mayor densidad que si están adheridas a una placa. Es un bioreactor típico con diseño sencillo y fácil monotorizar y controlar las distintas condiciones. Solo para células en suspensión o si queremos cel adherente tenemos que utilizar microcarrier. 3. WAVE BIOREACTORES “OLA”: se utilizan en GMP, donde podemos crece una cantidad alta de células y esta diseñado para usar y tirar y no haya riesgo de contaminación. Es util para crecer gran cantidad de células in contaminación y en condiciones controladas. El problema es que el coste es mucho mas alto. Recogemos células que no forman adherentes sino que están en suspensión. En muchos casos se requiere expandir células adherentes se utiliza microcariier o microcapsuslas a las que las células pueden estar adherida o sacafolds porosos que sirven para aumentar la superficie y poder ser crecidas en una densidad mayor. 4. HOLLOW FIBER BIOREACTIR: de fibras, donde tenemos un bioreactor a donde introducimos un scaffold una matriz porosa, donde las células van acrecer también adheridas. controlamos peor los distintos parámetros, las condiciones no son iguales y se da un gradiente, es difícil hacer un escalado para obtener células a nivel clínico. 5. ROTATING WALL VESSELS: pared rotatoria. El sistema es mas complejo. 6. PARALLEL PLATES BIOREACTOR: mas sofisticado. Se utiliza a nivel experimental. CELULAS UTILIZADAS MIOBLASTOS,ETC..

EN

ENSYAOS

CLINICOS:

MESENUQIMALES,

Las células madre limbocorniales van a permitir regenerar la cornea. Para ello, lo que se utiliza es la membrana amniótica: que no va a provocar inflamación, y es antigiogeneica (es decir nos interesa en algunos casos como ulceras en el ojo , material inerte para que se regenere al zona y no vascularizar la zona y volver al paciente ciego). Podemos pone la membrana amniótica en un bastidor, crece las células de biopsia en monocapa de limbo corneal y podemos cubrir la zona dañada (ulcera) a y a los meses degenar por completo VITILIGO: se produce por falta de melanocitos porque estos no producen melanina (mancha blancas en la piel). Para regenerar la zona preparamos membrana amniótica con células con melanocitos que luego ponemos sobre el paciente. Regeneración de la piel: en el caso de quemaduras graves. se obtienen queratinocitos y fibroblastos a partir de una biopsia de piel. Se extrae sangre del

paciente para obtener fibrina que forme una matriz sobre la cual se disponen las células. IPS: reprogramar una célula adulta a ips para sobreexprresar un factor expresado en pluripotencia : Oct4, Sox2, C-Mycm Klf4 con un retrovirus y sobrexpresarlos en las células.  Over embryonic fibroblasts feeders Plate irradiated Fbs o/n in DMEM + 10%FBS + P/S - iPS Media: DMEM + 15%KSR + P/S + Gln + NEAA + b-Mercapthoetanol +LIF (103 U/ml) -Culture: Split every 2-3 days 1/6-1/10 Como se cultivan: en el caso de las embrionarias e IpS los medios de cultivos son mas complejos dependiendo de si son de ratón o humanas utilizamos distintos factores de crecimiento Betta-mercaptoentanol es un antioxodante para ayudar a las células a estar...