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Preparaciones temporales Introducción Un hongo es fácilmente distinguible de los tejidos vegetales cuando se emplea un colorante diferencial, como azul de algodón en lactofenol. Para elaborar este colorante se debe preparar primero la solución de lactofenol, mezclando 20ml de ácido láctico, 30ml de glicerina, 20ml de agua destilada y 20g de fenol, calentando hasta que este último se derrita. A una mitad de la solución de lactofenol se le añaden 2.5 ml de una solución al 1.0% de azul de algodón en agua destilada. La tinción de Azul de lactofenol se emplea para observar hongos. (Brathwaite, 1995) Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal está basada en la afinidad del colorante por componentes de las células, en este caso por las estructuras fúngicas. El azul de lactofenol tiene tres características que lo hacen especial para observar dichas estructuras en los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos por aislamiento. El fenol destruye la flora acompañante (algunas veces en los cultivos, juntos a los hongos pueden crecer colonias de bacterias). El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al crear, por decirlo de algún modo, una película que las protege provocado por un cambio de gradiente osmótico entre el interior y el exterior de dicha estructura. El azul de algodón tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los hongos microscópicos. Con el objeto de lograr mejor observación microscópica de los microorganismos, células o tejidos que se han teñido es necesario montarlos temporal o permanentemente durante periodos más o menos prolongados en medios especiales para evitar que se deformen o destruyan. Una preparación microscópica se define como el resultado de una serie de operaciones destinadas a colocar material de observación en una capa de poco espesor, lo más pequeña y representativa posible. Pudiendo ser en seco, líquido o en vivo, o en partes sobre una superficie de vidrio transparente (portaobjetos) y cubierta algunas veces con otra de menor aumento y más delgada (cubreobjetos). Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Una preparación temporal es aquella que es utilizada en el momento de la observación, ya que requiere que el medio de montaje no se evapore tan rápidamente y que sea posible que el material biológico se conserve por un tiempo (algunos días) en condiciones de ser observado; las frescas solo se usan durante la práctica y posteriormente se lavan. Y Las permanentes son aquellas preparaciones

que duran por un tiempo más prolongado (unos años), por lo que se debe hacerse con un material especial como el bálsamo de Canadá o gelatina-glicerinada para que el cubreobjetos permanezca perfectamente adherido al portaobjetos. Es importante resaltar que, jamás hay que depositar un corte sobre un portaobjetos seco, siempre ha de haber un líquido que lo reciba. (Siurana, 2004) . Procedimiento.    

Colocar un trozo de cinta adhesiva sobre el hongo y presionar ligeramente para tomar una pequeña muestra. Poner una gota de azul de algodón en un portaobjetos limpio y sobre él, colocar la cinta con la muestra adherida. Fijar la cinta presionando ligeramente para lograr la tinción del hongo. Observar en el microscopio óptico.

Al finalizar la práctica, limpiar el microscopio Resultados

Muestras observadas en el microscopio

Fig 1 Hongo de rizopus al cual se extrajeron las diferentes muestras

Fig 2 Forma en que se prepararon las diferentes muestras: con una cinta adhesiva se extraían los micelos de los hongos

Fig 3 Muestra 1 extraído del hongo sin azul de lactofenol con objetivo de 10x

Fig 4 Muestra 2 extraído del hongo sin azul de lactofenol con objetivo de 10x

Fig 5 Muestra 1 hifas con azul de lactofenol observadas con objetivo 10x

FIg 6 Muestra 2 hifas con azul de lactofenol objetivo de 10x

Fig 7 Muestra 2 hifas con azul de lactofenol se puede apreciar sus “septas”. Objetivo 40x

Fig 8 Muestra 2 hifas con azul de lactofenol con objetivo 40x

Fig 9 Levadura con azul de metileno observadas con objetivo 10x

Fig 10 Esporangios sin azul de lactofenol, obsrvados desde objetivo 10x

Fig 11 Esporangios sin azul de lactofenol, observados desde objetivo 10x

Fig 12 Esporangios sin azul de lactofenol, se puede apreciar sus epongioesporas que se encuentran en el esporangiófobo observados desde objetivo 40x.

VI. Discusión de Resultados En la figura 1 se presenta la incubación de hongo Rhizopus oligosporus en una caja petri este hongo es de la familia de las Mucoraceae, ampliamente usado como levadura (cultivo arrancador) para la producción casera de tempeh. Las esporas producen un micelio blanquecino, esponjoso, uniendo a los granos de soja y

creando una "torta" comestible de granos de soja parcialmente fermentados. (Koseki T, 1992) Con poco aumento (10X) casi no fue apreciable la diferencia entre las muestras teñidas y las no teñidas (figura 3,4,5 y 6) sin embargo una célula no teñida tiene poco contraste con su entorno y por consiguiente es difícil de visualizar. Por consiguente, teñirla o colorarla nos sirven para ajustar la muestra a los requisitos óptico del sistema de imagen del microscopio para proveer de las condiciones óptimas de contraste y resolución y evitar que se oscurezca la imagen o se incorporen falsos detalles. Es así como en un mayor aumento (40X) logramos visualizar las septas. (Totora, 2007) Los hongos que observamos en la figura 7 y 8 entran en la clasificación de septados ya que sus hifas poseen tabiques transversales que las dividen en varias celdillas. Estos tipos de hongos pueden poseer uno o más núcleos en cada celdilla, en ellas existe un poro central en cada septo que permite al citoplasma y los núcleos puedan pasar de un compartimento a otro. Además se observa una clara diferencia pues cuando se le agregaba el azul de algodón lo que permitía es que se aclarara el fondo y la estructura de los hongos principalmente sus paredes se pudieran apreciar más. (García, 2004) Tipos de hifas a)no septadas b)sepatadas

En los hongos formados en una col morada (figura 10, 11 y 12) es apreciable la observación de esporangios los cuales son un recinto en el que se forman esporas. Puede estar compuesto de una sola célula o puede ser multicelular. Todas las plantas, los hongos y muchos otros linajes forman esporangios en algún momento de su ciclo de vida. Los esporangios se puede producir esporas por mitosis, pero en casi todas las plantas de la tierra y muchos hongos, esporangios son el sitio de la meiosis y producir genéticamente distintas esporas haploides.

Tiene estructura en forma de saco que contiene esporas, puede estar sostenido por un pedúnculo o esporangióforo. Rhizopus: 1. Hifas rizoidales 2. Hifas estolón 3. Esporangióforo 4. Esporangio 5. Columela.

Las levaduras que se observan en la figura 9 son hongos unicelulares las cuales están agrupadas en 305 especies, las células de las levaduras son relativamente grandes (si se compara con una bacteria común) su tamaño varía entre 1-5 𝜇m de ancho y 5 a 30 𝜇m de largo, aunque en su mayoría está entre 3 y 8 𝜇m de diámetro. (García, 2004). Su forma es ovoide, pero también hay alargadas y en las que observamos eran circulares. Su estructura es la de una eucariota, las levaduras no poseen flagelos ni orgánulos de locomoción (Montoya, 2008) Si las levaduras se ven sin agregarles nada se verían casi transparentes y no se distinguirían muy bien por ello el modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes, es decir de tincionarlos, en el laboratorio lo que utilizamos fue azul de metileno el cual es una tinción rápida e inespecífica lo que hace que tomen el color azul característico y se diferencien del medio. (Konemann, 2008) VII. Conclusiones Una preparación temporal consiste en observar los microorganismos vivos que puede haber en la muestra de estudio y la presencia de otros elementos, como son leucocitos, células, eritrocitos, bacterias, etcétera, que puedan ser de gran ayuda en la valoración de las muestras. Si la muestra proviene de una muestra sólida, se debe de agregar una gota de agua destilada; si el material es líquido, se deposita directamente entre el portaobjetos y cubreobjetos. Las técnicas de coloración permiten la observación morfológica con un mejor contraste que en las preparaciones temporales, así como la observación de estructuras celulares....