Primi step di genetica molecolare (Prof. Visioli) PDF

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Genetica molecolare: acidi nucleici (generale), duplicazione del DNA, trascrizione, sintesi proteica o traduzione. Descritte tutte le tappe con foto esplicative....

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GENETICA MOLECOLARE Gene: possiamo definire il gene come una sequenza di nucleotidi presenti all’interno del DNA di una cellula che agisce come unità funzionale per la formazione di un prodotto che può essere una proteina, un RNA strutturale o un RNA catalitico. DNA: ricordiamo le sue caratteristiche principali: - È un polimero di nucleotidi legati tra loro mediante legami fosfodiestereo tra posizione 3’ di un nucleotide e la posizione 5’ di un nucleotide successivo - I nucleotidi presenti del DNA sono dei desossinucleotidi in quanto lo zucchero presente è il desossiribosio - Le basi del DNA sono adenina timina citosina e guanina - La struttura tridimensionale è una doppia elica costituita da due filamenti complementari, tra i quali si instaurano dei legami a idrogeno che legano due basi affacciate (A+T mediante 2 legami a idrogeno oppure C+G mediante 3 legami a idrogeno) - Il DNA può andare incontro a denaturazione reversibile, ad esempio, innalzando la temperatura: legami a idrogeno si spezzano aprendo la doppia elica e abbassando poi la temperatura si riformano i legami a idrogeno e la struttura si riassembla I procarioti contengono un’unica molecola di DNA chiamata cromosoma batterico di forma circolare presente in una regione del citoplasma detta nucleoide. Oltre al cromosoma possono essere presenti ulteriori molecole di DNA chiamate plasmidi: si tratta di molecole circolari in grado di replicarsi contenenti pochi geni e in grado di essere trasferiti da un batterio all’altro.

Duplicazione del DNA Una volta definita la struttura del DNA è stato possibile studiare il modo con il quale è in grado di replicarsi ipotizzando che la molecola fosse in grado di auto replicarsi aprendosi mediante rottura dei legami a idrogeno e che i due filamenti fossero in grado ciascuno di fungere da stampo per la sintesi del proprio filamento complementare (=replicazione semi conservativa). La replicazione del DNA richiede un discreto numero di proteine ed enzimi e si svolge mediante due processi chiave: 1. Lo svolgimento della doppia elica in modo tale da rendere accessibili i due filamenti 2. La formazione di legami covalenti tra i nucleotidi che si appaiano al filamento stampo La replicazione ha inizio in corrispondenza dell’origine di replicazione su cui si lega un complesso proteico detto complesso di replicazione che contiene l’enzima in grado di legare i nucleotidi tra loro. Tale enzima dal momento che esegue una polimerizzazione del DNA e detta DNA polimerasi. L’enzima non è in grado di eseguire la sintesi ex novo ma necessita di un nucleotide con una posizione 3’ libera e tale nucleotide fa parte di un corto frammento che funge da innesco ( primer): questa sequenza è sintetizzata dall’enzima primasi e il primer alla fine verrà rimosso. Esistono molti tipi di DNA polimerasi nelle cellule alcuni dei quali sono coinvolti direttamente nella replicazione mentre altri hanno funzioni diverse; sono molte le proteine accessorie che intervengono nel processo di replicazione: - Topoisomerasi: sono proteine che rilassano il DNA rimuovendo i super avvolgimenti - DNA elicasi: intervengono nella separazione dei due filamenti di DNA - Proteine single stand binding Proteins: legano ai singoli filamenti di DNA impedendo loro di riappaiarsi Il punto in cui il DNA viene aperto per consentire l’azione di DNA polimerasi e detto forca o forcella di replicazione. A causa della direzionalità di copia da parte della polimerasi che sintetizza il nuovo filamento solo in direzione 5’-3’, I due filamenti di partenza non possono essere copiati alla stessa velocità proprio perché sono antiparalleli. Il filamento che va da 3’ a 5’ viene eletto in modo continuo dalla polimerasi ed è perciò detto filamento guida, mentre l’altro filamento che decorre in direzione opposta è copiato in modo discontinuo quindi a frammenti in direzione opposta rispetto al verso di avanzamento della forca replicativa ed è per questo detto filamento in ritardo.

I frammenti sintetizzati in direzione 5’-3’ sono detti frammenti di Okazaki ed ognuno di essi inizia con un primer inserito dalla primasi: al termine della replicazione questi vengono rimossi e gli spazi tra i frammenti di Okazaki vengono riempiti dalla DNA ligasi formando il filamento continuo. Il meccanismo di replicazione è estremamente accurato, ma può capitare che vengano inseriti nucleotidi errati; la DNA polimerasi può riconoscere quando ciò si verifica ed è in grado di fermarsi sostituire il nucleotide errato e ripartire (=correzione delle bozze/proofreading). Il processo di duplicazione descritto è valido sia nei procarioti che negli eucarioti: I primi però la replicazione parte da un’unica origine di replicazione ed è bidirezionale. Eucarioti sono più complessi ed avendo molti cromosomi è necessario che si formino più origini di replicazione dando origine a delle piccole unità di replicazione dette repliconi. Le DNA polimerasi batteriche sono molto veloci mentre quelle eucarioti che sono molto più lente. Negli eucarioti le estremità dei cromosomi (dette telomeri) neosintetizzati si accorciano ad ogni divisione perché quando nel frammento di Okazaki viene rimosso l’ultimo Primer, la polimerasi non è in grado sintetizzare DNA per rimpiazzarlo. Negli elementi cellulari in grado di dividersi in modo continuo è presente un enzima chiamato telomerasi in grado di conservare il DNA telomerico. Guardare ISTONI SU PPT RNA: L’RNA è un acido nucleico che differisce dal DNA per le seguenti caratteristiche: - Esiste in forma di singolo filamento mentre il DNA a una struttura a doppia elica - I nucleotidi di cui è composto sono costituiti da ribosio anziché desossiribosio - Una delle basi del DNA è la timina che nel DNA viene sostituita dall’uracile che è una base in grado di formare legami a idrogeno con l’adenina Come anticipato prima esistono tre tipi fondamentali di RNA: - rRNA: o RNA riposo male a un ruolo strutturale in quanto contribuisce alla formazione di ribosomi - tRNA: o RNA di trasferimento è fondamentale per la sintesi proteica in quanto lega un amminoacido specifico - mRNA: o RNA messaggero è il responsabile del trasferimento dell’informazione contenuta del DNA (nel nucleo) ai ribosomi (nel citoplasma o sulle membrane del reticolo endo plasmatico) per l’assemblaggio del prodotto codificato dalla sequenza di DNA + snRNA+miRNA+siRNA Esiste un flusso di informazione che parte dal DNA e giunge alle proteine che rappresentano il risultato finale dell’espressione genica attraverso un intermediario che l’mRNA; questo flusso di informazioni è noto come dogma centrale della biologia e afferma che: 1. Il DNA è depositario dell’informazione genetica ed è in grado di replicarsi

2. Attraverso un processo noto come trascrizione l’informazione presente in un segmento di DNA detto gene viene trasferita ad una molecola di mRNA 3. Il messaggio codificato dall’mRNA cioè in un linguaggio a quattro lettere come quattro sono gli acidi nucleici (basi), viene tradotto nel linguaggio a 20 lettere delle proteine: questo processo è noto come traduzione e porta alla sintesi della proteina Inizialmente la direzionalità era univoca ma in seguito alla scoperta dei retrovirus, virus nei quali patrimonio genetico è costituito da una molecola di RNA, E di un loro enzima (trascrittasi inversa) questo flusso è stato parzialmente rivisto.

Trascrizione Il processo di trascrizione è la sintesi di un RNA a partire da uno stampo costituito da un filamento di DNA. Oltre alla RNA polimerasi e agiscono altre proteine note con il nome di fattori di trascrizione. L’utilizzo dell’mRNA come copia dell’informazione presente in un gene permette il trasferimento dell’informazione stessa dal nucleo alla sede del suo utilizzo ovvero il citoplasma dove il messaggio verrà tradotto come vedremo in seguito. Il ruolo principale in questo processo è svolto dall’enzima RNA polimerasi e che è in grado di utilizzare il filamento di DNA come stampo sul quale sintetizzare una molecola di RNA che risulta completamente complementare al filamento stampo secondo la regola di appaiamento delle basi. Affinché la trascrizione possa avvenire sono necessari i seguenti componenti: - Un filamento di DNA che funge da stampo - I 4 nucleotidi ATP, CTP, GTP, UTP - RNA polimerasi Ricordiamo che la trascrizione produce un RNA perciò tale processo è responsabile della sintesi di tutte e 6 le tipologie di RNA. Possiamo suddividere l’intero processo di trascrizione in tre parti: inizio, allungamento e terminazione. Nella fase di inizio l’RNA polimerasi deve essere posizionata nel punto del gene da cui deve far partire la sintesi, via nei procarioti che negli eucarioti queste sequenze sono chiamate promotori. Come hai detto in precedenza l’RNA polimerasi non agisce da sola ma fa parte del cosiddetto complesso di inizio della trascrizione che contiene la polimerasi e altre proteine. Il promotore segnala l’inizio del gene e quale dei due filamenti di DNA deve essere trascritto. Nella maggior parte dei promotori eucarioti esiste una sequenza monte del punto di inizio della trascrizione che serve come sito di riconoscimento per il complesso di inizio: questa sequenza contiene un certo numero di T e di A ed è quindi definita Tata box. La proteina che si lega a questa regione si chiama TBP ed è essenziale per l’assemblaggio del complesso di inizio della trascrizione.

Una volta correttamente posizionata la RNA polimerasi e inizia la fase di allungamento svolgendo il DNA davanti asse e sintetizzando un filamento di RNA in direzione 5’-3’. L’enzima commette molti errori rispetto alla DNA polimerasi, ma ogni gene può essere trascritto molte volte, perciò, questo maggior tasso di errore non risulta determinante. Ogni gene è dotato di una sequenza di terminazione che fa sì che la RNA polimerasi e si allontani dal DNA e rilascia il trascritto appena formato che nei procarioti è pronto per essere utilizzato mentre negli eucarioti si trova sotto forma di trascritto primario: è un RNA immaturo che dovrà subire modifiche affinché possa svolgere le proprie funzioni qualunque sia il tipo di RNA di cui si tratti. Negli eucarioti l’mRNA sotto forma di pre-mRNA, vai incontro a tre principali eventi di maturazione: 1. Aggiunta di un cappuccio al terminale 5’ (capping) 2. Aggiunta di una coda di poli(A) all’estremità 3’ (poliadenilazione) 3. Mozione degli in troni e saldatura degli risoni tra loro (splicing) Splicing: la rimozione degli in troni e la legatura tra loro degli risoni è definita splicing; tale processo deve avvenire in modo accurato affinché l’informazione presente nell’mRNA non venga alterata. Durante la sintesi del trascritto primario ad ogni in troni si associa un complesso denominato spliceosoma, esso contiene delle strutture ribonucleoproteiche definite snRNPs (dette “/snurps/”)=proteine + snRNA. Analizzando i singoli aspetti del dogma centrale della biologia abbiamo descritto la duplicazione del DNA e la trascrizione quindi il passaggio conclusivo è la traduzione. La trascrizione vede entrare in gioco l’mRNA mentre per la traduzione è necessario il tRNA: quest’interprete riconosce una sequenza di tre lettere detta tripletta sull’mRNA chiamata codone attraverso il proprio antico donne associa poi al codone uno specifico amminoacido. L’amminoacido viene legato al ti RNA da un enzima detto amminoacil-tRNA sintetasi.

Sintesi proteica o traduzione = processo mediante il quale l’informazione scritta nel linguaggio degli acidi nuclei viene tradotta in quello delle proteine: in pratica l’mRNA viene letto e interpretato e come risultato finale sia la sintesi di una catena polipeptidica. Nel processo di sintesi proteica intervengono: mRNA, ribosomi, tRNA. Le due subunità dei ribosomi e si assemblano nel momento in cui deve iniziare la sintesi proteica e il ribosoma risulta costituito da alcuni siti importanti: - Il sito A ossia il sito dell’amminoacido è la zona del ribosoma dove l’antico donne del tRNA riconosce il codone dell’mRNA - Il sito P ossia il sito del peptide e il sito in cui il tRNA dona il proprio amminoacido alla catena nascente - Il sito E ossia sito di uscita è la zona in cui il tRNA ormai scarico attende di essere liberato dal ribosoma Possiamo schematizzare anche il

processo di sintesi proteica così come la trascrizione nelle fasi di inizio, allungamento e terminazione.

Inizio: la sintesi inizia mediante la formazione di un complesso di inizio costituito da un mRNA legato alla sub unità minore di un ribosoma; il codone di inizio è sempre rappresentato dalla sequenza AUG alla quale corrisponde un anticodone UAC presente in un tRNA di inizio che porta sempre l’amminoacido metionina. A questo punto grazie anche all’azione di proteine dette fattori di inizio la sub unità maggiore del ribosoma si associa il complesso di inizio e il tRNA legato alla metionina si trova nel sito P del ribosoma, mentre il sito A si allinea con il secondo codone pronto per accogliere il secondo tRNA. Allungamento: il nuovo aminoacetil-tRNA associato ad un fattore di allungamento entra nel sito A e si lega secondo codone dell’mRNA; a questo punto può avvenire la formazione di legame peptidico tra l’ultimo amminoacido della catena peptidica legata al tRNA presente nel sito P con l’amminoacido portato dal tRNA nel sito A. La formazione del legame peptidico è catalizzata da un ribozima e la catena nascente si trasferisce sul tRNA del sito A: il tRNA presente nel sito P è ora libero....