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BIOLOGIA MOLECOLARE Gli acidi nucleici, DNA e RNA, sono costituiti da catene polinucleotidiche, cioè polimeri lineari di unità chiamate nucleotidi ( costituiti da uno zuchero pentoso, una base azotata, uno o più gruppi fosfati; dna con desossiribosio e rna con ribosio, differiscono per gruppo OH presente sulla posizione due del ribosio e che manca nel desossiribosio - gruppo OH conferisce instabilità all’RNA ( DNA più stabile perchè ha un H in quella posizione)) Basi azotate negli acidi nucleici naturali sono di due tipi : purine ( a doppio anello eterociclico) e pirimidine ( a singolo anello). Due tipi di purine ( sia in rna che dna) adenina e guanina e tre tipi di pirimidine, citosina, timina e uracile. La differenza tra uracile e timina è la presenza di un gruppo metilico in posizione 5 dell’anello pirimidinico. Quando una delle suddette basi è legata alla posizione 1 di uno zucchero, abbiamo i nucleosidi ( adenosina, guanosina,citidina timidina e uridina) ; a questi possono essere legati uno o più gruppi fosfato e prendono il nome di nucleotidi ( acido adenilico, guanilico ecc..) Il gruppo fosfato conferisce una valenza acida alla molecola; può trovarsi legato al carbonio 5’ dello zucchero o al carbonio 3’. I nucleotidi possono contenere solo un gruppo fosfato o due o tre; i nucleotidi che vengono utilizzati come substrato per la sintesi del DNA e RNA hanno tre gruppi fosfato legati in serie sulla posizione 5’ dello zucchero. In questo caso i tre gruppi fosfato vengono indicati, a partire da quello legato direttamente allo zucchero, con alfa, beta e gamma. Una base legata allo zucchero si definisce nucleoside e se questo è legato al fosfato si chiama nucleotide. Lo scheletro della catena polinucleotidica è costituito dall’alternanza di zuccheri e di gruppi fosfato, e le basi sporgono lateralmente da questo scheletro. Ciascuna base è legata alla posizione 1’ di uno zucchero da un legame glicosidico che interessa l’N1 delle pirimidine o l’N9 delle purine. E’ un polimero di nucleosidi monofosfato; infatti, durante la sintesi degli acidi nucleici, ciascun nucleoside trifosfato utilizzato come substrato, perde due dei suoi tre gruppi fosfato. Ciascun grupppo fosfato forma un legame con il carbonio 5’ di uno zucchero e un secondo legame estere con il carbonio 3’ dello zucchero successivo. Questo tipo di legame, chiamato fosfodiesterico, conferisce una sorta di asimmetria, o meglio di polarità ,alla catena polinucleotidica, nel senso che questa presenta due diverse estremità : da una parte c’è un nucleotide che ha il carbonio 5’ libero, mentre il carbonio 3’ con un nucleotide adiacente; dall’altra la molecola polimerica termina con un nucleotide che ha il carbonio 5’ impegnato nel legame fosfodiesterico con quello adiacentre mentre il carbonio 3 è libero. Per convenzione le sequenze degli acidi nucleici di scrivono in direzione 5’ - 3’. Il gruppo ossidrile OH del carbonio 3’ di un nucleotide forma un legame estere con il fosfato di un altro nucleotide. Si forma un legame estere fosfodiesterico o fosfodiestere 5’-3’, liberando una molecola d’acqua e pirofosfato. - Erwin Chargraff si era accorto che preparazioni di DNa di origine diversa possono avere un differente contenuto delle quattro basi, espresse come contenuto percentuale. Concluse che, mentre organismi di diverse specie possono avere DNA con composizione in basi differente, il DNA preparato da diversi tessuti od organi della stessa specie ha sempre la stessa composizione in basi. Chargraff osservò che qualsiasi sia la fonte del DNA e nonostante la diversa composizione in basi, veniva sempre rispettata una regola ( che poi prese il suo nome) ; la percentuale di A è sempre uguale alla percentuale di T,e la percentuale di C è sempre uguale a quella di G . REGOLA NON VALIDA PER RNA.

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Secondo il modello proposto da Watson e Crick le coppie di basi, sono disposte perpendicolarmente rispetto all’asse della doppia elica, come a formare dei gradini di una scala a chiocciola. Vi è sempre l’appaiamento tra una A e una T e tra una G e una C, il che giustifica la regolarità del diamentro della doppia elica. Nelle coppie di basi A-T la A si trova davanti alla T con una geometria e una distanza tali da permettere la formazione di due legami idrogeno, mentre nella coppia G-C si formano tre legami idrogeno. Le catene sono antiparallele, quindi disposte con una polarità 5’-3’ opposta l’una rispetto l’altra. La doppia elica del DNA ha una struttura regolare, destrorsa , compie un diro completo ogni 34 amper e ha un diametro di circa 20. La distanza tra dye coppie di basi adiacenti è di 3,4 amper e ci sono, quindi, circa 10 coppie di basi per ogni giro di elica.L’elica presenta un’asimmetria dovuta alla posizione delle molecole di deossiribosio ai lati delle basi : infatti, come conseguenza dell’opposta polarità 5’-3’ delle eliche, i due zuccheri di ciascuna coppia di nucleotidi si vengono a trovare dallo stesso lato. Questa asimmeria genera, nella doppia elica due solchi di dimensioni diverse, detti appunto solco minore e maggiore ( importanti per i riconoscimento delle sequenza del DNA ; il solco maggiore ha molti più atomi che possono essere donatori o accettori di legami idrogeno). Le catene polinucleotidiche singole hanno una parte idrofilica, lo scheletro zucchero- fosfato e una parte idrofobica, le basi. I due scheletri zucchero-fosfato si dispongono all’esterno della struttura a contatto con l’acqua, mentre le basi (idrofobiche) vanno a disporsi all’interno all’interno sfuggendo così all’acqua. I due scheletri che contengono gli atomi di fosforo carichi negativamente tendono a respingersi; questa repulsione viene controbilanciata da due tipi di foze che tendono a mantenerle appaiate. Inanzitutto i legami idrogeno tra le basi; i legami H tra le basi contribuiscono solo in parte alla stabilità della doppia elica; questa infatti è aumentata dall’effetto idrofobico dovuto all’impilamento ( stacking) delle basi. Le coppie di basi adiacenti presentano una considerevole sovrapposizione, anche se non completa a causa della rotazione dell’elica. Questa sovrapposizione è stabilizzata dall’idrofobicità delle basi stesse che, cosi impilandosi, mantengono il minimo contatto con l’acqua. STRUTTURE ALTERNATIVE La struttura a doppia elica proposta da Crick e Watson è ottenuta mediante diffrazione dei raggi X di fibre di Dna in condizioni di alta umidità e quindi anche in soluzione acquosa. Questa struttura, identifica come forma B, NON è l’unica possibile ; se si riduce l’umidità relatia in cui si trova la fibra di DNA, quest’ultimo assume la forma A, destrorsa ma differente per : 1. le coppie di basi presentano una maggiore angolatura rispetto al piano perpendicolare all’asse della doppia elica; 2.ci sono 11 coppie di basi per ogni giro di elica ; 3. il passo dell’elica è di 25 amper e il diametro di 23, quindi presenta una forma un pò ‘’tarchiata’’ rispetto alla forma B. Mentre la forma B può essere assunta da duplex di DNA in condizioni non naturali di bassa umidità, la forma A la si trova anche in vivo, quindi in soluzione acquosa, per duplex formati da due filamenti di RNA oppure da un filamento di DNA e uno di RNA. Infatti la trpresenza dell’-Oh nella posizione 2’ del ribosio impedisce alla molecola di assumere la forma B. + Forma Z, la cui peculiarità è il fatto di essere un’elica sinistrorsa con un diametro di 18 amper e un passo di 46, quindi un elica ‘’magra e allungata’’ rispetto alla B. Struttura scoperta studiando DNA sintetici in cui G e C si alternano lungo la sequenza. La causa che genera il DNA Z è il cambiamento di orientamento del legame glicosidico tra la guanina e il deossiribosio. Nella forma B lo zucchero e la bae sono presenti nella conformazione ‘’anti’’ mentre nella forma Z si presentano nella

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rara conformazione ‘’syn’’ Nella stessa molecola di DNA possono coesistere tratti di DNA B e Z. Struttura scivolata; un filamento scivola rispetto all’altro e si formano delle anse ( a livello di ripetizioni in tandem, ossia due o più copie circa adiacenti di uno schema di nucleotidi,testa-coda) Strutture cruciformi e strutture a forcina quando in un duplex di DNA o RNA sono presenti, adiacenti o a breve distanza,due copie della stessa sequenza in orientamento opposto, queste vengono chiamate ripetizioni invertite. Se le due ripetizioni invertite sono adiacenti costituiscono,complessivamente, una sequenza palindromica, che è una sequenza di DNA duplex identica su entrambi i filamenti se letti nella stessa direzione 5’-3’. Dal punto di vista strutturale, un duplex che contenga delle sequenze ripetuta e invertitapuò assumere una struttura cruciforme. Infatti, ciascun filamento di una delle due sequenze ripetute trova una regione complementare cui appaiarsi adiacente nello stesso filamento.Le sequenze ripetute cosi appaiate intramolecolarmente costituiscono due ‘’steli’, mentre le basi che separano le due sequenze ripetute non hanno modo di appaiarsi e formano due’’anse’’. DNA curvo se consideriamo due coppie di basi che si susseguono in duplex, spesso queste non sono perfettamente parallele tra loro ma formano piccoli angoli; per esempio, due paia di basi A-T adiacenti hanno un intrinseca tendenza a piegarsi dalla parte del solco minore, mentre due paia di G-T hanno una tendenza inversa. Ne risulta che la doppia elica non è perfettamente dritta, ma presenta piccoli piegamenti. Questi, dato che la sequenzadi nucleotidi è eterogenea e casuale, tendono a elidersi a vicenda, cosicchè nell’insieme la struttura della molecola, pur con qualche deformazione, resta più o meno dritta. Se però un tratto contiene, due o tre paia di A-T consecutive, con una periodicità di 10 paia di basi ( cioè ripetute a ogni giro di elica) i piccoli angoli introdotti si sommeranno tra loro producendo un’apprezzabile curvatura dell’asse della molecola di DNA Tripla elica si può dire che un tratto di DNA duplex ragionevolmente lungo ( 20-30 copie di basi) che ha un filamento composto di sole pirimidine e l’altro di purine, può accogliere nel solco maggiore una terza catena polinucleotidica composta di sole pirimidine, anch’essa complementare alla sequenza purinica con cui interagisce. Però, questa catena polipirimidinica ha una polarità di 5’-3’ uguale a quella della seuqenza di purine e quindi inversa rispetto alla sequenza pirimidinica della doppia elica. In questa tratto le tre basi ( 2 pirimidine e una purina) si affacceranno verso l’interno della struttura formando legami idrogeno.In particolare, le purine formeranno legami H oltre che con le pirimidine del duplex anche con quelle della molecola extra. Questi particolari legami idrogeno non canonici si chiamano appaiamenti di Hoogsteen

( Atassia di Friedreich - malattia neurologica, causata da un espansione di un trinucleotide 5’-GAA-3’ nl primo introne del gene FRDA del cromosoma 9 che sintetizza la frataxina.) +

Quartetti G struttura che si può formare tra quattro tratti di DNA o RNA a singolo filamento che contengono ciascuno 3 o più G consecutive. Questi si affiancano l’un l’altra a formare una struttura a quattro filamenti tenuti insieme da legami idrogeno tra le G. I legami idrogeno che si formano tra le quattro G non sono quelli anonici tipo Crick e Watson, ma del tipo appaiamenti di Hoogsteen. La situazione più comune è

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quella dei quartetti di G intramolecolari, in cui i tratti di DNA contenenti le serie di G si trovano tutti su un singolo filamento che, ripiegandosi tre volte su stesso, forma il quadruplex. Esistono però varie altre situazioni : per esempio si possono avere quartetti di G intermolecolari in cui le 4 serie di G si possono trovare su due filamenti o anche su quattro filamenti diversi.

DENATURAZION O FUSIONE REVERSIBILE DEL DNA E’ lo svolgimento e la separazione del DNA. Si verifica quando si rompono i legami idrogeno. In vivo avviene molto velocemente. Può essere inotta, in vitro aumentando la temperatura. I legami fosfodiesterici restano intatti con l’aumento dell’agitazione termica, si supera la forza dei legami idrogeno,delle inteazioni idrofobiche e delle altre forze che stabilizzano il dsDNA 1. Aumentano l’assorbimento alla luce UV a 260nm del 40% (ipercromicità) 2. Le basi impilate fanno diminuire l’assorbanza ( data dall’anello aromatico della base) 3. Abbasando la temperatura il DNA si rinatura. Si può ibridare anche un DNA di diversa fonte, ma completamente . processo reversibile- ( sonde) Appaiamento di basi : avviene sia nel DNA duplex che in interazioni intra. e intermolecolari in RNA ( o DNA) a singolo. Si può verificare ibridazione DNA-DNA, RNA-RNA e anche DNARNA a 60°C vi è un DNA a doppio filamento. Come sappiamo l’aumento della T porta alla denaturazione, cioè svolgimento e separazione dei filamenti del DNA. A 80° C vi è temperatura di melting o fusione; il 50% delle molecole sono denaturate. Un piccolo umento in questa fase fa si che aumenti la velocità della denaturazione che avviene per rottura delle interazioni deboli. la ™ ( demperatura di fusione) è influenzata dal contenuto in GC, una maggiore presenza di GC ha una maggiore ™. La rinaturazione è specifica e avviene in due fasi : ● i filamenti in soluzione si incontrano per caso e se trovano basi completari, si formano brevi appaiamenti ● l’appaiamento di estende tipo chiusura lampo ANNEALING O IBRIDAZIONE : la capacità di due molecole (RNA o DNA) di ibridare tra loro costiruisce un test oreciso delle loro complementarietà l’ibridazione su filtro stabilisce se una soluzione di DNA denaturato contiene sequenze complementari ai filamenti immobilizzati sul filtro. Una preparazione di DNA viene denaturata e i singoli filamenti vengono attaccati su un filtro. Una seconda preparazione di DNA è aggiunta in soluzione. In genere viene marcata radioattivamente; aumentando la temperatura il DNA denatura e l’assorbimento aumenta. L’assorbimento diminuisce quando il DNA rinatura. Due sequenze possono ibridarsi anche se simili e non identiche, formando duplex imperfetto con interruzioni dove i nucleotidi sono diversi. STRUTTURA TERZIARIA DEL DNA ; La struttura a doppia elica del DNA presenta molti vantaggi , per esempio una stabile e protetta conservazione dell ‘informazione genetica al suo interno, e grazie alla complementarietà dei due filamenti è possibile individuare e correggere errori e rotture che possono prodursi nel genoma. Lo statto superavvolto del DNA contiene, come in una molla, energia che utilizzata proprio per aprire i due filamenti o alle origini di replicazione o nelle regioni dei promotori e, quindi,

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se da un lato la cellula si sforza di preservare l’informazione contenuta nel genoma, dall’altro investe una considerevole quantita d’energia per mantenere lo stato topologico sotto controllo. ( questa struttura però è un problema quando vi sono dei processi che richiedono l’apertura dell’elica e la separazione dei filamenti come trascrizione e nella replicazione) Per controllare il grado di superavvolgimento del DNA che, se eccessivo, può essere dannoso, è necessario che il DNA venga tagliato, su uno o entrambi i filamenti , fatto ruotare e infine rilegato. Per svolgere al meglio questo compito, gli organismi hanno selezionato una classe di enzimi che si chiamano topoisomerasi e che hanno la caratteristica di tagliare in maniera transiente uno o due filamenti. Consideriamo due filamenti circolari chiusi che si avvolgono l’uno intorno all’altro e immaginiamo che i due filamenti possano passare l’uno attraverso l’altro ed essere cosi separati. Il numero di volte che un filamento dovrebbe passare attraverso l’altro in maniera che essi possano essere completamente separati generando due circoli a singolo filamento,, si chiama numero di legame. La frequenza ( quante volte un filamento di avvolge sull’altro) e la posizione di entrambi nello spazio tridimensionale possono essere descritte da due DNA in generale, il twist (tw, tosione),e il writhe (wr, contorsione). Considerando il DNA in generale, il twist rappresenta il numero di giri della doppia elica rispetto all’asse centrale e definisce il grado di avvolgimento ella doppia elica. In un DNA superavvolto, il writhe è il numero di volte che l’asse centrale della doppia elica incontra se stesso, formando i superavvolgimenti che sono visibili al microscopio ellettronico. La somma di queste due grandezze, indica il numero di volte che un filamento si avvolge sull’altro ed è appunto il numero di legame Lk -- Tw+Wr = Lk in caso di superavvolgimento positivo il DNA è instabile poichè contiene più energia. Superavvolgimenti negativi: Ogni cellula superavvolge negativamente il suo DNA. Questo facilita la separazione dei filamenti. E’ un modo per conservare energia torsionale, Il DNA negativamente avvolto può essere mantenuto solo se : - Il DNA è circolare e chiuso - Il DNA è legato e stabilizzato da proteine Topologia ( o arrangiamento personale) del DNA diventa importante ogni volta che il DNA svolge un compito nel complesso nei processi che determinano la vita cellulare : si replica durante la divisione cellulare; è trascritto ; è condensato nel nucleo cellulare ; è riparato se mutato. DNA TOPOISOMERASI : Lo stato topologico del DNA deve essere tenuto sotto controllo e per fare questo la doppia elica deve essere aperta e richiusa temporaneamente; uno o entrambi i filamenti del DNA devono essere taliati,manipolati rispetto ai filamenti interi e poi rilegati. Una classe di enzimi, chiamati DNA topoisomerasi, hanno la comune caratteristica di creare un tagio transiente sul DN, mediante una tirosina che si lega covalentemente allo scheletro fosfato, con una reazione di transesterificazione fatta dal suo gruppo OH. Il gruppo Oh libero del filamento tagliato, attraverso una reazione inversa, attacca il legame tra la tirosina e il DNA, ripristinando la continuità della doppia elica. Anche se non richiede energia, l’intero processo di modificazione topologica utilizza l’energia libera contenuta nel DNA superavvolto. Esistono due principali strategia d’azione delle DNa topoisomerasi;

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nella prima, chiamata rotazione controllata, l’enzima introduce una singola rottura su un filamento della doppia elica e permette la rotazione su se stesso del filamento intatto per un numero variabile di giri, fino a che l’attrito tra il DNA e l’enzima induce la rilegazione del filamento tagliato. il secondo meccanismo, comune a molte DNA topoisomerasi, è definito strand passage ( passaggio del filmaento) e consiste nel creare una rottura singola o a doppio filamento sul DNA, allargare l’interruzione prodotta e far passare l’altro filamento o la doppia elica attraverso la rottura che successivamente verrà risaldata

Il modo in cui viene tagliato è alla base della classificazione degli enzimi : - topoisomerasi di tipo I ( in genere monomeri), tagliano un solo filamento del DNA al 5, creando un apertura mediaa da interazioni di diversi domini dell’enzima con la doppia elica; meccanismo strand passage che permette di eliminare con efficienza strutture annodate sul DNA, nonchè di decatenare due filamenti di cui uno contenga una rottura a singolo filamento e di rilassare esclusivamenti superavvolgimenti negativi - non richiedono ATP - tutte le topoisomerasi di tipo II ( dimeri o multimeri) introducono un taglio su entrambi i filamenticon le due tirosine covalentemente legate all’estremità 5’ e portano avanti le modificazioi topologiche facendo passare un secondo tratto a doppia elica attraverso la rottura. Il filamento si chiama segmento G per gate, il segmento che passa attraverso l’apertura si chiama T per transport. Il meccanismo d’azione delle topoisomerasi di tipo II viene definito a doppio cancello. Le topoisomerasi di tipo I producono una rottura transitoria di un legame fosfodiesterico: attacco ossidrilico del OH della tirosina del sito attivo al gruppo P del DNa formando un legame covalente fosfoirosina tra enzima e DNA (TRANSESTERIFICAZIONE) - Avvolgono le estremità rotte covalentemente legate - Fanno passare il filamento integro sotto la rottura - legame delle estremità tagliate : l’ossigeno del 3’OH libero del DNA attacca il P della fosfotirosina scindendo il legame covalente enzima- DNA e ripristinando il legame fosfodies...