Appunti - Linfociti T regolatori - Biochimica e Biologia Molecolare - a.a. 2014/2015 PDF

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Appunti dettagliati sui T regolatori (integrazione da testi)...

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Linfociti T-Regolatori (T-reg) I linfociti T si distinguono in varie popolazioni caratterizzate da funzioni e caratteristiche diverse. I linfociti T regolatori (T-reg) o T-Suppressor sono una delle specializzazioni dei T, in grado di sopprimere l’attivazione dei sensori dell’immunità andando a modulare l’omeostasi e determinando la tolleranza verso gli autoantigeni. Modelli murini sperimentali dimostrano che l’azione immunodeprimente di queste cellule potrebbe essere utilizzata per trattare malattie autoimmuni, facilitare la tolleranza al trapianto o essere selettivamente eliminate per potenziarel’immunoterapia del cancro. Le Treg, sopprimendo le risposte effettrici di altre cellule, sono un importante “self-check” insito nel sistema immunitario, capace di prevenire reazioni eccessive una volta che l’antigene è stato eliminato limitando così il danno tissutale. Le Treg derivano da diversi tipi cellulari, alcune esprimono la glicoproteina di membrana CD8, altre CD4 CD25 e Foxp3 (fattore di trascrizione fondamentale per la differenziazione aTreg), altre si differenziano da tipi a funzione suppressor come TR1, Th3, CD8+CD28-, e quelle ristrette per Qa-1 (HLA-E per la specie umana). Non avendo marker fenotipici caratteristici si riconoscono per le maggiori citochine prodotte, TGFbeta, IL-10, per la scarsa attitudine proliferativa, per una bassa produzione di citochine linfotrope (in particolare IL-2 e INF-γ) e per la capacità di sopprimere la produzione di queste citochine anche in cellule effettici attivate come CD8+ (CTL), CD4+(a funzione Th1 o Th2), NK, cellule dendritiche e macrofagi. La sola produzione di IL-10 e TGF-b da parte delle cellule Treg non sembra però essere sufficiente a produrre un effetto soppressivo ottimale, cosa che si osserva, invece, quando le cellule effettrici e quelle regolatorie sono in diretto contatto, suggerendo il coinvolgimento di molecole di superficie che fino a oggi non sono state ancora ben definite. Il timo ha un ruolo importante nella generazione delle Treg come dimostra l’autoimmunità prodotta dalla timoctomia neonatale a tre giorni nei ratti.Tutte derivano da cellule progenitrici del midollo osseo che poi migrano nel timo come CD4- CD8-TCR-(fase di doppio negativo DN).Nel timo ogni singola cellula riarrangia i geni per il TCR per formare un’unica molecola funzionale. I timocici con TCR gamma delta, a differenza di quelli con TCR alfa beta, non subiscono selezione positiva e negativa. Se il TCR alfa beta lega con bassa specificità il complesso MHC-Ag-self espresso dalle cellule epitelio-reticolare della corticale timica, le Tcell verranno selezionate positivamente ricevendo segnali proliferativi e saranno risparmiate dalla morte per apoptosi (selezione positiva, restrizione per MHC autologo).In questa fase esprimono contemporaneamente CD4 e CD8 (doppio positivo DP). I timociti sopravvissuti alla selezione positiva subiranno successivamente una selezione negativa che assicura la tolleranza agli antigeni

self legati all’ MHC (tolleranza centrale). La selezione a Treg avviene attraverso il legame del TCR con molecole MHC-II espresse dalle cellule dendritiche e macrofagi e dai corpuscoli di Hassal nella zona midollare timica e a seconda del diverso signallyng esprimeranno in misura maggiore CD4 o CD8 (singolo positivo).Alla fine della fase di singolo positivo esprimono Foxp3 e si differenziano come Treg. In un primo tempo si pensava che i TCR, espressi dalle Treg, avessero una tasca recettoriale più grande e che riuscissero a legare antigeni glico-lipidici similmente a NKTo γδ T. Studi recenti dimostrano, invece. che esso è simile a quello delle cellule effettrici ma con una capacità di riconoscimento spostata verso peptidi self. Il processo esatto di selezione aTreg è ancora sconosciuto anche se sembra essere determinato dall’affinità di interazione con il complesso MHC-peptide-self, processo detto Goldilocks. Se le cellule T ricevono segnali molto forti andranno in apoptosi, se deboli sopravvivranno e saranno scelti per diventare cellule effettrici, ma se una cellula T riceve un segnale intermedio diventerà una cellula regolatoria. A causa della natura stocastica del processo di attivazione delle cellule T tutte le popolazioni di Tcell alla fine avranno una miscela di TCR, tipo T-eff e T-reg,e le proporzioni relative saranno determinate dall’ affinità delle cellule T per il peptide-self-MHC. In modelli murini con TCR transgenico, selezionati con specifici antigeni espressi dalle cellule stromali si evidenzia che la cancellazione o la conversione dei due tipi non è mai completa. La generazione di T Foxp3 + nel timo è ritardata di alcuni giorni rispetto alle cellule Teff e non raggiunge i livelli dell'adulto nel timo o negli organi linfoidi periferici fino a circa tre settimane dopo il parto poiché sembra che per la differenziazione a Treg sia necessaria una costimolazione attraverso il legame CD28 (sulla cellula T) e B7.2 (sulla DC o macrofago) la cui espressione è in gran parte limitata alle cellule presenti nella zona midollare timica. Inoltre per la funzionalità dei Treg timici non è importante l’azione del TGF beta come verificato su topi TGFβ-R-II-DN negativi, cosa fondamentale, invece, per la differenziazione a CD8 o CD4. Resta da capire come l'attività Treg moduli la risposta immunitaria perché se da una parte previene lo sviluppo di malattie autoimmuni, dall’altra non è auspicabile durante la risposta a microrganismi patogeni o in corso di neoplasie. Le ipotesi attuali suggeriscono che l’incontro con microrganismi infettivi produrrebbe una inibizione diretta delle Treg o indiretta attraverso altre cellule del sistema immunitario per facilitare l'eliminazione dell'infezione. Nonostante tutto, prove sperimentali dimostrano che alcuni agenti patogeni si siano evoluti per manipolare le Treg, immunosopprimendo l’ospite per potenziare la propria sopravvivenza. Infatti l'attività Treg aumenta considerevolmente in infezioni da retrovirus come per HIV, da micobatteri, in varie parassitosi comprese Leishmania e Plasmodium. Inoltre TGF beta e IL-10 sono le maggiori citochine presenti nell’ambiente extracellulare tumorale. In origine, per identificare e monitorare le Treg si usavano Ab monoclonali per rivelare con tecniche di citometria o immunoistochimica, un’alta espressione di CD4 e CD25 (recettore per IL-2), ma nel corso di una risposta immunitaria ad un agente patogeno

anche i LT CD4+ maturi a funzione helper lo sovraesprimono. Poi si è pensato di monitorare FOXP3 fattore di trascrizione della famiglia genica Forkhead (Forkhead box P3) necessario per lo sviluppo delle cellule Treg perché controlla un programma genetico che specifica questa differenziazione. Infatti. FOXP3 mutato, è responsabile di una grave sindrome autoimmune sistemica con esito fatale nel primo anno di vita nota come Immuno-disregulation Polyendocrynology Enterophaty X Linked IPEX. Purtroppo FOXP3 è espresso transitoriamente anche in cellule T effettrici attivate. Di conseguenza, alcuni gruppi di ricerca hanno pensato di usare come marker l'assenza o il basso livello di espressione della proteina di superficie CD127 (recettore dell’IL7) in combinazione con la presenza di CD4 e CD25. Diversi altri marker sono stati descritti, ad esempio, alti livelli di CTLA-4 (cytotoxicT-lymphocyte associated molecule-4) e GITR (glucocorticoid-induced TNF receptor) espressi sulle Treg ma il significato funzionale non è ancora completamente definito. Oltre alla ricerca di una nuova proteina marker, un metodo diverso per analizzare e monitorare più selettivamente le Treg è stato descritto in letteratura. Questo metodo si basa sull’analisi della metilazione del DNA. Solo in cellule Treg e non in qualsiasi altro tipo di cellule T effettrice anche attivata, una certa regione all'interno del gene FOXP3 (TSDR, T reg Demetilated Region) si trova demetilata, consentendo di monitorare le cellule Treg attraverso una reazione di PCR o altri metodi basati sul DNA....