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La PCR è una tecnica di biologia molecolare che permette l’amplificazione in modo selettivo di un tratto definito di DNA del quale si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. La reazione è catalizzata dall'enzima DNA polimerasi La PCR è una reazione ciclica costituita da 3 passaggi successivi: denaturazione del DNA (94-99°) , annealing appaiamento degli oligonucleotidi (50-60°), estensione della catena nascente del DNA complementare a cui vengono incorporati i nucleotidi (68-75°). Una reazione di PCR avviene all'interno di microprovette poste all’interno di un termociclatore che permette di impostare tempo,temperatura e numero di cicli. che All'interno di ciascuna microprovetta vengono inseriti i seguenti componenti che permettono la reazione in soluzione: • DNA stampo che si desidera riprodurre; • dNTPs nucleotidi per la sintesi dei nuovi filamenti; • primers (forward e reverse) , costituiti da brevi sequenze di DNA (oligonucleotidi) complementari agli estremi dei due filamenti del segmento da riprodurre; • DNA polimerasi termo-resistente • Buffer per mantenere il pH reazione e MgCl2

stabile (tampone) e necessario per costituire l'ambiente

adatto

alla

• nucleasi-free acqua per portare a volume la soluzione. - Check del prodotto di pcr per mezzo di corsa elettroforetica su gel di agarosio e letture delle rispettive bande ottenute - Criticità: trattamento pre analitico dei campioni, contaminazioni (cross contamination, carry over), procedure scorrete dell’operatore, concentrazioni e quantità corrette dei componenti di reazione, tempo,temperature delle tre fasi e numero di cicli. - Precauzioni da adottare: separazione fisica degli ambienti di estrazione del DNA, pcr e analisi successive degli amplificati; allestimento della reazione di pcr sotto cappa a flusso laminare, flusso unidirezionale del lavoro, utilizzo DPI, decontaminazione dell’ambiente di lavoro e della strumentazione usata, conservazione corretta dei reagenti e dei campioni. Principali tipologie: rt-pcr : reverse transcriptase : pcr che permette di ottenre copie di dna partendo da rna mediante uso di transcriptasi inversa e dna polimerasi. nested pcr : consiste nell’utilizzo di due coppie di primers, una esterna che genera un normale prodotto di PCR ed una coppia con primers all’interno del prodotto amplificato competitiva: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA attraverso l’amplificazione in contemporanea con un DNA standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di reazione. Il campione standard si amplifica con la stessa coppia di inneschi del DNA di interesse.

multiplex: consente di amplificare contemporaneamente diversi segmenti dello stesso campione di DNA utilizzando coppie di primers diversi

real time: permette di monitorare l’andamento in tempo reale della reazione di pcr usando inneschi fluorescenti e di misurare la quantità di dna di partenza Utilizzata per ottenere amplificati di DNA necessari per successive indagini ( sequenziamento, southern blot, elettroforesi) SANGER Il sequenziamento del DNA determinare l’esatta sequenza l’ordine in cui le basi contenute nel campione a tutte le metodiche

è delle si in di

il processo basi nucleotidiche, susseguono nelle esame. È possibile sequenziamento:

1. preparazione del

campione

di

DNA

2. amplificazione

dei

3. processo

sequenziamento

di

che permette di cioè di conoscere molecole di DNA riconoscere tre fasi comuni

frammenti vero

e

proprio

Il protocollo prevede inizialmente l’amplificazione delle molecole di DNA da sequenziare. L’amplificazione è l’operazione con cui si ottengono molte copie identiche delle molecole originali e può essere eseguita in due modi: con l’uso di plasmidi (in caso di sequenziamento de novo) o tramite la PCR (in caso di ri-sequenziamento). La successiva fase di sequenziamento inizia con la denaturazione delle molecole in input, che porta alla separazione dei due singoli filamenti di DNA. Il successivo passaggio è il primer annealing, che crea un punto di partenza per la sintesi del filamento complementare, catalizzata da una DNA polimerasi. La reazione di sintesi del filamento è iniziata aggiungendo alla soluzione contenente i filamenti di DNA l’enzima DNA polimerasi e i quattro nucleotidi dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). Alla miscela vengono inoltre aggiunti dei dideossinucleotidi (ddNTP) in quantità inferiore rispetto ai dNTP e marcati con un fluorescente. I ddNTP possonoessere incorporati nel filamento sintetizzato dalla DNA polimerasi esattamente come un nucleotide normale, ma comportano la terminazione dell’elongazione del filamento generato. Il rapporto tra dNTP e ddNTP è tale da consentire la polimerizzazione di un tratto notevole del

filamento ottengono

prima che venga aggiunta così quattro

famiglie distinte di terminano tutti in e così via. diversa,secondo terminazione. I covalentemente a un

una

molecola

di

ddNTP.

Si

nuovi filamenti: una che contiene filamenti che dATP, una di filamenti che terminano in dTTP Ogni famiglia comprende filamenti di lunghezza la posizione in cui è avvenuto l’evento di ddNTP sono marcati per fluorescenza, cioè legati fluorocromo il cui

colore identifica univocamente lo di filamenti saranno perciò distinguibili tipo di

fra loro, ddNTP che

specifico

anche se

unite

ddNTP. Le

in

quattro

un’unica

famiglie

miscela.

Il

costituisce l’ultima base del filamento è quindi noto, rimane incognita la lunghezza del filamento, cioè la posizione del ddNTP. Questa informazione si ottiene applicando l’elettroforesi capillare, un’evoluzione della tecnica originaria che utilizzava invece l’elettroforesi su gel. Si fanno passare i filamenti di DNA all’interno di un capillare, ai capi del Capitolo 2. Il sequenziamento del DNA 15 quale è applicata una differenza di potenziale; il DNA è carico negativamente e i frammenti migrano quindi verso il polo positivodel capillare. Questo è riempito di un gel che ostacola la migrazione dei frammenti: quelli di lunghezza inferiore saranno meno ostacolati nel percorso e percorreranno il capillare in un tempo minore permettendo di separare i filamenti in base alla loro lunghezza. All’uscita del capillare, un laser eccita i marcatori fluorescenti provocando emissioni elettromagnetiche, captate da un rilevatore che ne riconosce la lunghezza d’onda ottenendo la “traccia” Sanger, poi elaborata dal software in picchi di colore diverso (elettroferogramma). Note le lunghezze dei frammenti e il ddNTP con cui terminano è immediato leggere la sequenza: se un frammento è lungo 20 nt e il marcatore è del colore che identifica una G, in posizione 20 della read ci sarà una G. La tecnologia Sanger permette di ottenere sequenze di lunghezza tra i 600 e i 1000 nucleotid sequenziando comunemente fino a 96 sequenze, con un throughput giornaliero di 6 Mb. Gli errori di sequenziamento sono imputabili principalmente all’amplificazione, a contaminazioni del campione e a errato riconoscimento dei ddNTP edella lunghezza delle sequenze, a causa di errori nella separazione elettroforetica. Mediamente, il tasso di errore medio (media valutata su tutte le basi della sequenza) è comunque piuttosto basso

sanger Il metodo di Sanger consiste nella sintesi di nuovi filamenti di DNA complementari ad uno stampo a singolo filamento, in presenza di ddNTP (terminatori dideossi); avviene in 5 fasi:

1. Il campione di DNA da sequenziare viene clonato in un vettore e denaturato per ottenere lo stampo a singolo filamento in quantità sufficiente.

2. Lo stampo a singolo filamento viene suddiviso in 4 provette di sintesi con l'aggiunta di: o

un primer specifico complementare al filamento da sequenziare e marcato radioattivamente

o

la DNA polimerasi

o

una miscela dei 4 dNTP

o

un ddNTP diverso in ognuna delle 4 provette e in concentrazione 1:100 rispetto al dNTP corrispondente

3. Al termine della reazione di sintesi ogni provetta conterrà nuovi frammenti di DNA marcati di lunghezza diversa (a seconda della posizione 3' in cui è stato incorporato il ddNTP) che vengono poi caricati in 4 pozzetti diversi e separati con elettroforesi su gel di poliacrilammide. 4. I frammenti (che hanno l'estremità 5' marcata) vengono visualizzati attraverso autoradiografia come bande radioattive di lunghezze diverse. 5. La sequenza del DNA viene ricostruita a partire dall'estremità 5' a quella 3' (cioè dal frammento più corto a quello più lungo) in base alla posizione delle bande nei diversi pozzetti, che corrisponde alla terminazione della sintesi a livello di una delle 4 basi nucleotidiche per incorporazione di un ddNTP. Successivamente è stata introdotta una variante del metodo originale, in cui i frammenti di Sanger sono prodotti mediante amplificazione con PCR di una piccola quantità di DNA stampo a doppio filamento, quindi non è più necessario il clonaggio del DNA da sequenziare e si può utilizzare DNA a doppio filamento. Inoltre si utilizzano primer o ddNTPs marcati con 4 fluorocromi differenti, quindi si possono far correre i frammenti in un'unica corsia e, soprattutto, la sequenza può essere letta in modo automatizzato:

1. Vengono allestite 4 reazioni di PCR con: o

il DNA stampo da sequenziare a doppio filamento

o

un solo primer (per ottenere soltanto il filamento complementare allo stampo)

o

la Taq DNA polimerasi

o

una miscela dei 4 dNTP

o

un ddNTP marcato con un fluorocromo diverso in ognuna delle 4 provette e in concentrazione 1:100 rispetto al dNTP corrispondente

2. Per ogni reazione si genera una miscela di frammenti a singolo filamento che vengono poi caricati in un unico pozzetto e separati per elettroforesi 3. Durante l'elettroforesi i frammenti vengono eccitati da una luce laser, passano davanti a un rilevatore che capta la lunghezza d'onda e l'intensità delle emissioni fluorescenti e identifica quale nucleotide è presente nella banda. 4. Le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso (uno per ogni nucleotide) con aree proporzionali all'intensità di emissione. Il metodo di Sanger automatizzato ha reso possibile il sequenziamento di interi genomi come quelli di Haemophilus influezae, S. Cerevisiae e E. Coli....