Biomol - Exercícios sobre Biologia molecular e Biotecnologia. PCR, Eletroforese PDF

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Exercícios sobre Biologia molecular e Biotecnologia. PCR, Eletroforese...

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1. Conjunto de técnicas que utiliza os seres vivos, ou suas partes e componentes, no desenvolvimento de processos e na obtenção de produtos que tenham uma função econômica ou social. 2. A Biotecnologia abrange diferentes áreas do conhecimento que incluem a ciência básica (Biologia Molecular, Microbiologia, Biologia celular, Genética, Genômica, Embriologia etc.), a ciência aplicada (Técnicas imunológicas, químicas e bioquímicas) e outras tecnologias (Informática, Robótica e Controle de processos).Engenharia Genética ocupa um lugar de destaque como tecnologia inovadora, seja porque permite substituir métodos tradicionais de produção (Hormônio de crescimento, Insulina), seja porque permite obter produtos inteiramente novos (Organismos transgênicos). 3. Embora esteja presente na vida humana há muito tempo, a biotecnologia passou a ter nome e a ser amplamente estudada há pouco, em meados do século passado. Num primeiro momento, esteve voltada para a saúde humana e animal, em que se utilizou de microrganismos para a fabricação de antibióticos, como é o caso da penicilina, por Alexander Fleming, em 1929. Em 1953, os cientistas James Watson e Francis Crick descreveram a estrutura do DNA e tornaram possível a manipulação e o estudo aprofundado do DNA de qualquer espécie viva. Com o passar do tempo, observou-se que, em detrimento do crescimento populacional, seria necessário aumentar a produção agropecuária e reduzir o uso de adubos químicos e agrotóxicos, buscando-se “equipar” plantas e animais domésticos com defesas genéticas contra patógenos e pragas. Entre as décadas de 1960 e 1970, o cenário começou a mudar em relação à agricultura mundial. Nos países em desenvolvimento, iniciava-se a Revolução Verde, período marcado pela disseminação de novas práticas a fim de intensificar a produção agrícola a partir de intensos programas de melhoramento genético clássico, uso intensivo de insumos e mecanização. Nesse período, os grandes centros de pesquisa, pressionados pela Revolução Verde, passaram a investigar mais a biotecnologia aplicada à agricultura, momento em que a engenharia genética iniciou a transferência controlada de genes para vegetais, a produção de vacinas transgênicas e outras proteínas terapêuticas. Assim, foi desenvolvida a primeira planta transgênica da história, em 1983, após anos de estudo e experimentos frustrados. Pesquisadores revolucionaram o melhoramento genético de plantas ao fazerem com que sequências de genes responsáveis pela expressão de uma substância chamada nopalina fossem inseridas no DNA circular da bactéria Agrobacterium tumefaciens e então transferidos para uma variedade de tabaco. O tabaco transgênico passou assim a também produzir a proteína nopalina. A principal finalidade do projeto foi verificar se era realmente possível a transferência e a incorporação de novos genes em plantas, sendo que a característica ou trait inserido foi totalmente destinado para fins de pesquisa. O experimento abriu várias portas e possibilitou o desenvolvimento de plantas transgênicas com novas características, uma vez que cerca de 20 anos depois a primeira espécie alimentícia destinada ao mercado seria lançada. A partir de então, cresceu o interesse, e as pesquisas relacionadas, sobre aplicação de técnicas de biotecnologia para melhoramento de vegetais. Anos mais tarde, em

1994, o órgão responsável pela regulamentação de variedades vegetais transgênicas nos Estados Unidos, o Food and Drug Administration (FDA), aprovava o tomate “Flavr Savr“. Desenvolvido pela empresa americana Calgene, o produto foi o primeiro derivado de uma planta geneticamente modificada a ser comercializado. Em 2000, foi sequenciado o genoma de uma planta pela primeira vez. A escolhida foi a espécie Arabidopsis thaliana, uma pequena herbácea da família da mostarda. A Arabidopsis foi escolhida como planta modelo, o que permitiu um grande avanço em relação ao estudo das características essenciais de como as plantas funcionam e à possibilidade de modificação genética, não apenas nessa espécie como também em vários outros vegetais. No Brasil, a primeira aprovação para um cultivo geneticamente modificado foi em 1998, com a soja RR da Monsanto, tolerante ao herbicida glifosato. No entanto, devido a ações judiciais movidas pelo Greenpeace e o Ipac, seu plantio começou apenas em 2003, quando o órgão responsável pela avaliação de biossegurança no Brasil (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança – CTNBio) entendeu que a apresentação de estudos de impactos ambientais era desnecessária, visto que já existiam relatos dos países em que a soja era aprovada comercialmente e pesquisas científicas suficientes para a sua aprovação (SILVA, 2004). Atualmente, a soja RR é a mais cultivada no Brasil. Ela foi obtida por meio da transferência de uma enzima da bactéria Agrobacterium tumefaciens à soja, tornando-a tolerante ao glifosato. 4. Na Medicina: ● ● ● ● ●

Produção de insulina, medicamentos e vacinas; Manipulação de animais, como o porco, para utilizar os órgãos em transplantes; Produção de anticorpos em laboratório para pacientes com sistema imunitário deficiente; Terapia gênica para tratamento de doenças como câncer, neurológicas e cardiovasculares, cujos tratamentos convencionais não são eficientes; Pesquisa com células-tronco para fins terapêuticos.

Na agricultura: ● Produção de insumos, tais como: fertilizantes, sementes e agrotóxicos; ● Melhoramento genético de plantas; ● Processamento de alimentos: alimentos transgênico. No meio ambiente: ●

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Biorremediação: dependendo do tipo de contaminação e das condições do ambiente são usadas diferentes técnicas para reduzir ou eliminar contaminações no meio ambiente; Bioconversão de resíduos provenientes da agricultura; Produção de biocombustíveis a partir de organismos vivos ou de resíduos vegetais; Produção de plástico biodegradável a partir de microalgas.

Biotecnologia industrial:

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Obtenção e conservação de alimentos; Vinhos, vinagres, cervejas, pães, queijos, leite fermentado e etc; Utilização de bactérias e fungos; Fermentação alcoólica, láctica e acética.

Biotecnologia científica: ● ●

Desvendar o funcionamento dos organismos; Genômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica.

5. Um dos usos da biotecnologia na saúde humana mais conhecida é o da insulina, que possibilitou aos diabéticos injetarem a insulina para controlar a glicemia sem risco de rejeição imunológica. Outra aplicação seria o uso de vacinas, como a da hepatite B. 6. Lise celular – detergentes: SDS, CTAB, etc • Desproteinização - fenol, clorofórmio • Precipitação do DNA: etanol, isopropanol • Remoção do RNA - tratamento com RNAase • Verificação do grau de pureza do DNA – eletroforese, A260/A280 • Armazenamento da amostra: ultrafreezer (-70 ºC) 7. As primeiras proteínas recombinantes terapêuticas em biofármacos foram classificadas como de primeira geração, consistem em proteínas com sequência de aminoácidos idêntica às proteínas nativas presentes em organismos sadios, para simples reposição ou aumento de nível circulante em pacientes com deficiência das mesmas. 8. Pode ser aplicada através da técnica da Agrobacterium; as agrobactérias são microorganismos que vivem no solo e tem a capacidade de penetrar em algumas espécies vegetais, causando um tumor nas mesmas. Essa bactéria, Agrobacterium tumefaciens, possui um plasmídeo indutor de tumor chamado de Ti e com a engenharia genética esse plasmídeo é modificado, assim as linhagens de Agrobacterium que perderam parte ou todo o seu T-DNA, passam a ser incapazes de produzir tumores nas plantas hospedeiras. Outra aplicação é a cultura de tecidos, que faz a clonagem de vegetais, o melhoramento genético e a produção de mudas sadias. 9. O DNA pode ser transferido para a célula vegetal pelo método biológico utilizando a bactéria Agrobacterium tumefaciens e pelo bombardeamento com micropartículas , onde partículas de ouro ou tungstênio são cobertas com DNA e aceleradas em direção ao tecido da planta (hélio comprimido). As partículas perfuram a parede celular e penetram dentro da célula; 10. O projeto Tomate Flavr Savr, trata-se de um tomate geneticamente modificado, o primeiro alimento aprovado para o consumo humano, que buscava desacelerar o processo de amadurecimento do tomate, mantendo sua cor e sabor natural, impedindo assim, que estragasse rápido. Para evitar a rápida decomposição do tomate, um gene foi adicionado um gene que interfere na produção da enzima poligalacturonase. Esses tomates modificados são então colhidos antes de estarem maduros e sendo amadurecidos com o uso de gás etileno. Um melhor sabor destes tomates era alcançado através do melhoramento tradicional de Flavr Savr. 11. Através do melhoramento genético convencional de variedades de B. napus e B. rapa, e posteriormente de B. juncea foi desenvolvido variedades de canola com baixos

níveis de ácido erúcico. O nabo, a couve, a couve-de-bruxelas, a mostarda, e vários outros vegetais são relacionadas às duas variedades de canola naturais comumente cultivados. A mudança de nome serviu para distingui-lo do óleo natural das variedades disponíveis até o início dos anos 70, que tinham um teor muito mais elevado de ácido erúcico. O óleo de canola tem ômega 3 e ácidos graxos monoinsaturados, consagrados como substâncias benéficas para o coração. 12. O Projeto Golden Rice trata-se um arroz modificado geneticamente com o objetivo de produzir grandes quantidades de betacaroteno, atuando no fortalecimento do sistema imunológico e no combate aos radicais livres que aceleram o envelhecimento. Esse arroz foi desenvolvido a partir da inserção de genes presentes na planta Narcissus pseudonarcissus e na bactéria Erwinia uredovora no DNA do arroz da variedade Oryza sativa. 13. A soja RoundUp Ready, o algodão Bt e as sementes de milho geneticamente modificadas. 14. A primeira proteína terapêutica humana a ser produzida em plantas foi o hormônio de crescimento humano em calos celulares de girassol e tabaco. 15. A proteína verde fluorescente é ligada ao gene que o cientista quer que seja expresso, então os organismos que expressam o gene desejado também expressão a proteína e brilham no escuro. 16. As bactérias podem produzir grandes quantidades proteínas terapêuticas são de fácil manipulação, não existem leis de proteção a bactérias, assim como existem para vertebrados, tem plasmídeos que facilitam a inserção de genes. Elas não podem produzir proteínas grandes que precisam de processos pós transcricionais. 17. As leveduras podem produzir proteínas grandes que precisam de processos pós transcricionais, como as bactérias podem ser produzidos em larga escala para produzir grandes quantidades de proteínas terapêuticas. 18. As células de mamíferos já produzem as proteínas grandes prontas , porém podem ser infectadas por doenças que os humanos também são infectados e por isso a purificação dessas proteínas precisam ser muito bem feitas. 19. As proteínas secretadas no leite das cabras e vacas são produzidas em grandes quantidades e podem suprir um país inteiro, como acontece na Argentina ou uma única vaca produz hormônio de crescimento humano suficiente para a demanda do país todo. Porém manter um animal desses é caro além do processo de purificação dessas proteínas precisar ser feito com muito cuidado, pois são vertebrados e podem transmitir doenças para os seres humanos. 20. Os animais transgênicos como ratos de laboratório e peixes tem um tempo de geração curto; fácil manutenção dos estoques; produção em larga escala dos animais geneticamente modificados através de SMGT - Sperm Mediated Gene Transfer e transmissão de vírus e príons não são conhecidas até o momento entre peixes e humanos. Uma importante desvantagem é a rejeição da população a proteínas secretadas nos fluidos desses animais como urina, sangue e sêmen.

21. Plantas podem ser biorreatores com produção em larga escala de proteínas grandes e complexas, além de nenhuma patologia de plantas conhecida pode infectar humanos. A desvantagem é que plantas precisam de um espaço maior para seu cultivo. 22. O melhoramento genético dos animais e a criação de novas raças feito por seleção artificial. 23. Uma célula somática é retirada da ovelha jovem que vai ser clonada e um ovócito de outra ovelha adulta, o núcleo dessa célula é retirado e no lugar dele é posto o núcleo da célula somática, depois ele entra em divisão e esse embrião é implantado na ovelha adulta doadora do ovócito. 24. Em uma plantação onde um fungo ataca as folhas da planta e degrada sua parede celular. A tecnologia de silenciamento seria utilizada na planta, para que no momento em que o fungo ataca a planta, sua enzima que degrada a parede celular da planta não fará mais efeito, e a planta ficará intacta. 25. Um dos desafios é de perpetuar, com alta fidelidade, um genoma e ao mesmo tempo permitir erros que originam a variabilidade necessária para a evolução. 26. A biologia sintética tem sido estudada para aplicações em design artificial, engenharia de sistemas biológicos e organismos vivos, com propósito de realizar novas tarefas na indústria e pesquisa biológica. Em outras palavras, visa o desenho, construção e caracterização de novos circuitos regulatórios através da utilização de partes biológicas e modelos computacionais com o objetivo de redesenhar microrganismos para aplicações biotecnológicas. 27. A biotecnologia no meio ambiente pode ser aplicada em biodegradação, que consiste em desintegrar materiais utilizando bactérias, fungos e outros organismos e também pode ser aplicada na biorremediação, que consiste no uso de enzimas de organismos como bactérias, fungos e plantas na redução ou remoção de contaminantes no ambiente. 28. Biotratamento de resíduos consiste na reciclagem de húmus, nutrientes e/ou energia de resíduos biológicos por meio de processamento aeróbico ou anaeróbio. Biodegradação consiste em desintegrar materiais utilizando bactérias, fungos e outros organismos. Bioaugumentação é a prática de se adicionar cepas de comunidades de microrganismos especializados, ativos e em crescimento a microrganismos endógenos de um hábitat, num esforço de se aumentar a habilidade das comunidades de microrganismos nativos a responder a flutuações no processo de biodegradação. Os biosensores são ferramentas analíticas que utilizam um elemento bioativo e um transdutor para a detecção/quantificação de substâncias bioquímicas nas mais variadas aplicações. A biorremediação consiste no uso de enzimas de organismos como bactérias, fungos e plantas na redução ou remoção de contaminantes no ambiente. Já o biomonitoramento consiste no uso de seres vivos como ferramenta para mensurar a qualidade ambiental baseando nas respostas desses às alterações ambientais. 29.Os plasmídeos são moléculas extracromossomais de formato circular encontrado

no DNA bacteriano. Eles tem a capacidade de duplicação independente, ou seja, realizam sua multiplicação sem a necessidade do DNA cromossomal, além disso são capazes de se transportar de bactéria para bactéria. Isso possibilita que os plasmídeos garantam resistência a antibióticos, além de aumentar a possibilidade de uma célula bacteriana causar alguma doença. 30. Inserto de DNA é um fragmento de DNA com extremidade abrupta ou coesiva inserido em um vetor, é um alvo a ser usado para a construção da molécula de DNA recombinante. Um vetor é uma molécula de DNA em que o fragmento de DNA a ser clonado é ligado ao DNA de uma célula. Um vetor pode, por exemplo, carregar consigo um gene resistente a antibióticos, replicar-se com autonomia, e possuir uma sequência conhecida por endonuclease. 31. As enzimas de restrição ou endonucleases, são capazes de reconhecer e se ligar a sequências específicas de DNA, chamadas de sítios de restrição. Assim que a enzima encontra a sequência alvo, ela corta a dupla hélice da molécula de DNA. Existem três tipos de enzimas de restrição, a tipo I, tipo II e tipo III. As enzimas tipo I e III necessitam de ATP para se mover ao longo da molécula de DNA e os sítios de ligação e de corte são diferentes. Já o tipo II, tem o modo de ação mais simples, pois não necessita de ATP e os sítios de corte são previsíveis/específicos, por esse motivo essa enzima é a mais utilizada atualmente pelos engenheiros genéticos. 32. O nome da enzima de restrição inclui uma letra maiúscula, correspondente à inicial do gênero do microrganismo do qual foi purificada, e duas letras minúsculas, correspondentes às duas primeiras letras dessa espécie microbiana; estas três letras devem ser escritas em itálico. Em alguns casos, segue-se no nome uma outra letra maiúscula, indicadora da estirpe e/ou de um número romano que representa a ordem cronológica do seu isolamento de um mesmo organismo. 33. Os sítios de restrição são as sequências específicas de bases nitrogenadas reconhecidas por uma enzima de restrição onde a dupla fita irá ser cortada. Quando reconhecidas por uma enzima de restrição tipo II, esta irão atuar em sequências palindrômicas de 4 a 6 pb e cortar dentro dessa sequência. 34. As extremidades podem ser coesivas ou cegas. As extremidades coesivas apresentam um pequeno número de nucleotídeos em cadeia simples, capazes de se associar por ligações de pontes de hidrogênio, com outra cadeia simples em que a sequência de bases seja complementar desta. Já a extremidade cega não possui a capacidade de estabelecer entre si pontes de hidrogênio por complementaridade de bases. Desta forma, a ligação de dois fragmentos deste tipo, quando em baixa concentração, é muito mais difícil que a ligação de dois fragmentos com extremidades coesivas. 35. Para ligação de fragmentos de DNA, apenas os que possuem extremidades compatíveis, normalmente as extremidades abruptas são compatíveis. Aqueles fragmentos com extremidades coesivas obtidas com a mesma enzima de restrição isosquizomeras são compatíveis. 36. DNA ligase é uma enzima de adesão do DNA. Se dois pedaços de DNA tiverem terminações complementares, a ligase pode ligá-las para formar uma molécula de

DNA única e contínua. Sua função é de selar o vão entre as moléculas, formando assim um único pedaço de DNA. 37. Primeiro o DNA é isolado através de métodos de extração de DNA/RNA, depois é realizada a ligação ao vetor através de enzimas de restrição, ligase, ente outras. Em seguida, ocorre a transformação, a seleção do clone de interesse e por fim, o sequenciamento, gerando número de cópias, sequenciamento do DNA ou um mapa de restrição por exemplo. 38. Primeiro é realizado a lise celular com o uso de detergentes como SDS, em seguida a desproteinização com o uso de formol por exemplo, depois a precipitação do DNA utilizando etanol, posteriormente é feita a remoção do RNA feito através do tratamento com RNAse. Depois é realizada a eletroforese a fim de verificar o grau de pureza do DNA e por último, a amostra é armazenada em freezer. 39. Sua função é causar o rompimento da membrana plasmática e membrana nucleares. 40. Para que haja formação do pellet, ou seja, para que os componentes mais densos e maiores se concentrem no fundo do tubo. 41. Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade em geral aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade. A precipitação de DNA é realizada por meio da utilização de etanol absoluto associado a uma solução com alta concentração de um sal catiônico. O etanol induz a transição estrutural nas moléculas de ácido, fazendo-as se agregarem, com conseqüente precipitação. A precipitação com etanol absoluto, além de concentrar o DNA, ajuda a remover resíduos de fenol e de clorofórmio presentes na amostra. 42. A espectrofotometria baseia-se na absorção da luz por moléculas dispersas em uma solução. Os ácidos nucléicos absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm. Para fazer a leitura no espectrofotômetro, normalmente se utiliza uma diluição em água. As proteínas absorvem luz no comprimento de onda de 280 nm. Sendo assim, a relação A260/A280 fornece um parâmetro de avaliação da qualidade das preparações de ácidos nucléicos. Valores inferiores a 1,8 resultam de contaminação com proteína. Com a espectrofotometria de visível é possível estimar os ácidos nucleicos DNA e RNA, “corando-os”, embora se...