Principi di cromatografia di affinità PDF

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Principi di cromatografia di affinità La cromatografia di affinità è basata su una interazione tra una proteina di interesse, ed un legante immobilizzato su una fase stazionaria. La cromatografia di affinità separa proteine sulla base di una interazione reversibile tra una proteina (o gruppo di proteine) ed un legante specifico accoppiato ad una matrice cromatografica. La tecnica offre alta selettività, quindi alta risoluzione, e solitamente elevata capacità per la(e) proteina(e) di interesse. La purificazione può essere dell'ordine di diverse migliaia di volte ed il recupero di materiale attivo è generalmente molto elevato. La cromatografia di affinità è l'unica tecnica che permette la purificazione di una biomolecola, sulla base della sua funzione biologica o struttura chimica individuale. La tecnica può essere utilizzata per separare biomolecole attive da diverse forme denaturate, per isolare sostanze pure presenti a bassa concentrazione in grandi volumi di campione e anche per rimuovere contaminanti specifici. La proteina bersaglio viene raccolta in una forma purificata, concentrata Le interazioni biologiche tra legante e molecola bersaglio possono essere un risultato di interazioni elettrostatiche o idrofobiche, forze di van der Waals e/o legami idrogeno. Per eluire la molecola bersaglio dal mezzo di affinità, l'interazione può essere invertita, specificamente con un legante competitivo, o non specificamente, modificando il pH, la forza ionica o la polarità. In un unico passaggio, la purificazione per affinità è in grado di offrire un enorme risparmio di tempo rispetto a procedure meno selettive. L'effetto di concentrazione consente di trattare grandi volumi. Le molecole bersaglio (target) possono essere purificate da complesse miscele biologiche, forme native possono essere separate dalle forme denaturate della stessa sostanza e piccole quantità di materiale biologico possono essere purificate da elevati quantità di sostanze contaminanti. Per un livello ancora più elevato di purezza, o quando non c’è un adatto legante per la purificazione di affinità, deve essere sviluppato un processo efficiente multi-step utilizzando la strategia di purificazione della Capture, Intermediate Purification and Polishing (CIPP). Quando si applica questa strategia, la cromatografia di affinità offre una cattura ideale o una fase intermedia in qualsiasi protocollo di purificazione e può essere utilizzata, quando è disponibile un legante adatto per la proteina di interesse. La purificazione per affinità richiede un legante biospecifico che può essere legato covalentemente ad una matrice cromatografica. Il legante accoppiato deve mantenere la sua affinità di legame specifico per

le molecole bersaglio e, dopo aver lavato via il materiale non legato, il legame tra il legante e la molecola bersaglio deve essere reversibile per consentire di rimuovere le molecole bersaglio in una forma attiva. Ogni componente può essere usato come un legante per purificare il suo rispettivo partner di legame. Alcune tipiche interazioni biologiche, spesso utilizzate in cromatografia di affinità, sono:

• enzimi Û substrato analogo, inibitore, cofattore; • Anticorpo Û antigene, virus, cellula; • lectina Û polisaccaride, glicoproteina, recettore cellulare di superficie, cellula; • acido nucleico Û sequenza di base complementare, istoni, polimerasi di acido nucleico, proteina legante l’acido nucleico; • ormone, vitamina Û recettore, proteina carrier; • glutatione Û glutatione-S-transferasi o proteine di fusione GST. • ioni metallici Û proteine Poly (His) di fusione, proteine native con istidina, cisteina e/o residui di triptofano sulle loro superfici. Esempi di legant: Proteina Substrato analogo Inibitore Cofattore Enzima Antigene Anticorpo Recettore ormonale Specificità della Cromatografia di Affinità

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La specificità è basata su tre aspetti dell’affinità:

1) la matrice; 2) il legante; 3) il fissaggio dei leganti alla matrice. •

La specificità è basata su tre aspetti dell’affinità:

1) la matrice; 2) il legante; 3) il fissaggio dei leganti alla matrice.

Matrice Gruppi amminici, idrossilici, carbonilici e tiolici presenti sulla matrice servono come siti di legame

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del legante. •

Le matrici sono costituite da agarosio e da altri polisaccaridi.

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La matrice deve inoltre essere in grado di sopportare il processo di decontaminazione che prevede il risciacquo con idrossido di sodio o urea.

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Matrici di affinità

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Gel exclusion stationary phase matrices work well in affinity chromatography because

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1.Physically and chemically stable under most experimental conditions

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2.Relatively free of non-specific adsorption effects

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3.Very large pore sizes

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4.Reactive functional groups for ligand attachment

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Some matrices used include:

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•Agarose (eg. Sepharose 4B)

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•Polyvinyl

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•Polyacrylamide (Bio-Gel A 150)

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•Controlled porosity glass

Ligand •

The Ligand binds only to the desired molecule within the solution

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The ligand attaches to the matrix which is made up of an inert substance

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The ligand should only interact with the desired molecule and form a temporary bond

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The ligand/molecule complex will remain in the column, eluting everything else off

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The ligand/molecule complex dissociates by changing the pH

So many ligands so little tme

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The chosen ligand must bind strongly to the molecule of interest

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If the ligand can bind to more than one molecule in the sample a technique, negative affinity is performed - this is the removal of all ligands, leaving the molecule of interest in the column - done by adding different ligands to bind to the ligands within the column

Mode of binding between protein and dye •Interaction between protein and dye not well understood •Dyes have aromatic rings •Heterocyclic •Conjugated double bonds •Sulfonic acid groups to give water solubility •Hydrophobic •Electrostatic hydrogen bonding

Specific ligands •IgG antibodies •Must be raised against epitope •Monoclonal or polyclonal •Cross-linked to CNBr-activated Sepharose 4B •Can elute with salt •Need very low pH to break binding

Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) •Based on the affinity of metal ion for basic amino acid residues •Ions mostly used include Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+ and Fe2+ •Metal ion is immobilized by partial coordination binding by IDA, NTA and TED (Triscarboxymethyl Ethylene Diamine) •Affinity is caused by metal ion not being fully coordinated •Solvent and buffer molecules coordinate weakly •Basic amino acid residues such as histidine, tryptophan and cysteine coordinate much more strongly Protein is eluted with: •imidazole (structural analog of histidine) •elution buffer pH can be dropped to 6, where histidine is protonated and cannot bind coordinately to Ni2+ Tandem affinity purificaton (TAP) •A purification procedure that allows isolation of protein complexes would be useful •Although one-step IMAC yield pure protein, it is seldom homogenous •TAP tag is based on having two tandem affinity tags in protein •Most frequent is calmodulin binding protein (CBP) followed by protein A

•CBP binds to the protein calmodulin in the presence of Ca2+ •Protein A binds IgG immunoglobulins •The CBP and protein A sequences are separated by a TEV protease site (ENLYFQE) •This sequence is cleaved by TEV protease •The protein is first bound to Sepharose beads covered with IgG •Adsorbed protein cleaved with TEV protease and eluted •Binding to calmodulin column •Elution with Ca2+ •This allow two-step ultra-pure protein preparation •Very mild conditions allow isolation of protein complexes

Attachment of the ligand to the matrix The covalent attachment of the ligand to the matrix requires: 1. Activation of the matrix 2. Attachment of the ligand to the activated group Many activated matrices are commercially available: • CNBr-activated agarose Sepharose 4B • 6-aminohexanoic acid (CH)-agarose • 1,6-diaminohexane (AH) agarose • Carbonyldiimidazole (CDI)-agarose • Epoxy-agarose...