Protokoll Blut-2 PDF

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Protokoll zum Thema "Blut" für das Praktikum-Tierphysiologie. (WS 16/17)...

Description

1. Bestimmung der Erythrozyten- und Leukozytenzahl

Methode: Ziel des Versuches ist die Bestimmung der Erythrozyten- sowie Leukozytenzahl mittels einer Zählkammer nach THOMA sowie der Vergleich dieser mit Normwerten. Für ein genaueres Ergebnis wird ein Durchschnittswert aus mehreren Zählungen gebildet.

Versuchsdurchführung: - Reinigung d. THOMA-Kammer, Abdecken mit Spezialdeckglas - für Erythrozytenzählung : mit 5 µl heparinisierter Kapillare Blut v. Probanden entnehmen Blutprobe mit 995 µl HAYEMscher Lösung (1:200) mischen Mischung in Mischpipette aufnehmen, THOMA-Zählkammer mit Bluttropfen bestücken 3 min warten (Absetzen d. Erythrozyten), dann auszählen (5 gr. Quadrate) -für Leukozytenzählung : mit 10 µl heparinisierter Kapillare Blut v. Probanden entnehmen Blutprobe mit 90 µl TÜRKscher Lösung (1:10) mischen Mischung mit Pipette aufnehmen, THOMA-Zählkammer mit Bluttropfen bestücken 3 min warten (Absetzen d. Leukozyten), dann auszählen (gesamte Zählkammer)

Ergebnisse & Auswertung: Eryt h rozyten ∕ μl=

øn 1 1 2 1 mm ⋅ mm ⋅ 200 10 25

n = Zahl der ausgezählten Zellen je

großes Quadrat Leukozyten ∕ μl=

n 1 1 1m m ⋅ mm ⋅ 10 10 2

Thoma-Kammer

n = Summe aller ausgezählten Zellen in der

Erythrozyten Leukozyten

Summe d. ausgezählten Zellen 118,4 72

Berechnete Blutkörperchenzahl 5 920 000 7 200

Die Normwerte für Erythrozyten je µl Blut liegen bei Frauen zwischen 4,1x106 und 5,4x106 (1). Der Wert unserer Probandin ist im Vergleich also leicht erhöht. Dies könnte auf eine Erkrankung der blutbildenden Zellen oder eine Austrocknung (Dehydrierung) hindeuten (2), jedoch sind auch Fehler beim Auszählen der THOMA-Platte oder eine zufällige Akkumulation der Zellen an den gezählten Stellen möglich. Die Leukozytenzahl liegt genau im Normbereich , welcher bei 2000 – 10000 je µl Blut liegt (Skript). (1) http://flexikon.doccheck.com/de/Normalwerte#Kleines_Blutbild http://www.vitanet.de/krankheiten-symptome/blut-blutkrankheiten/blutbild/kleines-blutbild

2. Färbung eines Blutausstrichpräparates (panoptische Färbung)

Methode: Färbung aller Blutbestandteile

Versuchsdurchführung: Zunächst wird der Blutausstrich angefertigt. Wenn dieser getrocknet ist, wird die MayGrünwald-Lösung aufgetropft. Das Methanol in der Färbelösung dient zur Fixierung des Aufstriches. Nach Lufttrocknung (3-5 min) diesen mit destilliertem Wasser abgießen (nicht abspülen!). Die verdünnte Giemsa-Lösung hinzugefügen und nach 10-13 min ebenfalls mit destilliertem Wasser abspülen und zwischen Filterpapier trocknen.

Ergebnisse: Die Mehrzahl der Zellen im Blutausstrich waren Erythrozyten. Diese waren schwach rosa gefärbt und in typischer bikonkaver, kernloser Form vorliegend. Des Weiteren waren Monocyten (mit violettem Kern und bläulichem Zellplasma), neutrophile Granulozyten (rötlich-violetter Kern, Plasma hellrosa) und Lymphozyten (bläulich-violett gefärbt) in kleiner

Anzahl zu erkennen. Granulocyten waren in dem Fall häufiger vorhanden als die anderen beiden Zelltypen. Thrombozyten waren nicht zu erkennen. Die Zeichnungen sowie fotografische Aufnahmen der Zellbestandteile befinden sich im Anhang. Die panoptische Färbung wird auch als Pappenheim-Färbung bezeichnet, wobei die eingesetzten Färbelösungen saure Farbstoffe (Eosin) und basische Farbstoffe (Azur-II, Methylenblau) enthalten, welche die verschiedenen Bestandteile der Zellen unterschiedlich anfärben. Die DNA des Kerns und die RNA sind saure Bestandteile der Zelle, also basophil und färben sich mit basischen Farbstoffen bläulich-violett. Zellbestandteile wie die Proteine und das Hämoglobin sind basische, acidophile Bestandteile und färben sich so mit den sauren Farbstoffen rosa bis rötlich an.

Lymphozyt Neutrophiler Granulozyt Erythrozyten Farbreste

Abb. 1: Panoptische Färbung und Zellbestandteile im Blut (Mikroskop-Bild-Ausschnitt)

Monocyt

Abb. 2: Panoptische Färbung der Zellbestandteile im Blut Fehlerbetrachtung: An bestimmten Stellen war ein Farbüberschuss zu erkennen, welcher zuerst zu einer falschen Einschätzung der Zellen führte. Auch Farbreste auf dem Objektträger wurden als dunkle Flecken gezeigt, die zuerst mit Thrombozyten verwechselt wurden. Quellen: -

Praktikumsskript Vorlesungsskript „Blut“ Bilder vom Praktikumstag (selbst aufgenommen) http://www.phywe.fr/index.php/fuseaction/download/lrn_file/versuchsanleitungen/ P5921500/d/p5921500d.pdf http://binder-ventil.de/wp-content/uploads/2014/12/pappenheimfaerbung.pdf

3. Blutgruppenbestimmung und Bestimmung des Rhesus-Faktors beim Menschen

Methode: Anhand von Testseren werden Blutgruppe und Rhesus-Faktor der Praktikumsteilnehmer bestimmt.

Versuchsdurchführung: 1.) Blutgruppenbestimmung - mittels steriler Impflanzette wird von 2 Gruppenmitgliedern an einer gereinigten Fingerkuppe mehrere Blutstropfen entnommen (Ecken eines sauberen Objektträgers) - auf der Tüpfelplatte je 1 Tropfen der Testseren Anti-A, Anti-B und Anti-AB mit je einem Tropfen Blut versetzt und verrührt - die Reaktion läuft innerhalb von 1-2 min ab, zeigt sich an Flockigwerden der Blutmischung (Agglutination) 2.) Rhesus-Faktor Bestimmung - Blut mittels Einmal-Kapillarröhrchen (20 µl) entnehmen und in kleinem Reaktionsgefäß mit Kochsalz-Lösung (200 µl) verdünnen

-

in feuchter Kammer: ein Tropfen des verdünnten Blutes auf Objektträger mit einem Tropfen Anti-D-Serum vermischen, mit Dextrangelatine bedeckt 30 min bei Zimmertemperatur ruhen lassen Danach leicht schwenken, sodass Grad der Agglutination bestimmt werden kann

Ergebnisse: Agglutinierendes Blutgruppenserum Anti-A Anti-B Anti-A + Anti-B Blutgruppe  = Agglutination o = keine Agglutination

Proband 1 (Fenja) o

Proband 2 (Elisabeth) 



o

 B

 A

Rhesus-Faktor

+

+

(fotografische Abbildungen der Versuche auf der nächsten Seite)

▼Blutgruppen-Bestimmung mit deutlicher Reaktion (Agglutination):

Proband 2

Proband 1

Anti-A

Anti-B

Anti-A+B

◄Rhesusfaktor-Bestimmung: Oben – Proband 1, Unten – Proband 2

Auswertung: Bei Proband 1 (Fenja) reagieren die Antikörper B und A+B (Serumfaktoren) mit den Antigenen. Es ist eine klare Agglutination zu erkennen. Demnach resultierend hat Fenja die Blutgruppe B, d.h. sie besitzt B-Antigene (Galactose) auf der Erythrozyten-Oberfläche und Antikörper A im Plasma. Die Blutgruppe B ist mit nur 11% in Deutschland vertreten und gehört deshalb zu den seltenen Blutgruppen. Bei Proband 2 (Elisabeth) reagierten die Erythrozyten mit den Antikörpern A und A+B mit den Antigenen, weshalb sie die Blutgruppe A hat. Das heißt Elisabeth besitzt A-Antigene (NAcetylglucosamin) auf den roten Blutkörperchen und Antikörper B im Plasma. Blutgruppe A kommt mit 43% neben Blutgruppe 0 (41%) am häufigsten in Deutschland vor. Beide Probandinnen reagieren positiv auf das Anti-D-Serum, d.h. es trat eine Agglutination auf, und sind somit Rhesus positiv (Rh-D+). 85% der Deutschen sind rhesus-positiv und nur 15% rhesus-negativ. Im Vergleich mit den Blutgruppen aller Kursteilnehmer (insgesamt 17 Teilnehmer, deren Blutgruppe bekannt ist) kommen wir auf folgendes Schema:

Häufigkeit der Blutgruppen im Kurs E 60%

53%

50% 40% 30% 18%

20%

12%

10% 0%

A+

0-

B+

6%

6%

6%

0+

AB+

A-

Prozentualer Wert

► Blutgruppenhäufigkeit in Deutschland (AB0- und RhesusSystem); Quelle: Vorlesungsskript „Blut“, S. 46

Neun Praktikumsteilnehmer besitzen Blutgruppe A, rhesus-positiv (53%), gefolgt von drei Kursteilnehmer mit Blutgruppe 0, rhesus-negativ (18%) und zwei Personen mit Blutgruppe B, rhesus-positiv (12%). Blutgruppe AB, rhesus-negativ liegt nicht vor und die restlichen Blutgruppen hat jeweils ein Kursteilnehmer. Der erste Wert bestätigt dabei die generelle Häufigkeit der Blutgruppe A+. Die Blutgruppe 0ist anders als in der allgemeinen Bluthäufigkeit in unserem Kurs auf dem zweiten Platz. Menschen mit dieser Blutgruppe werden auch als Universalspender für Vollblut genannt, da sie mit jedem Blut kompatibel sind. Die restlichen Blutgruppen stimmen mit der Verteilung in Deutschland weitestgehend überein. Durch die geringe Teilnehmerzahl des Kurses kommt es zu Abweichungen. Um genauere Werte zu erzielen müssten mehrere Probanden getestet werden.

Fehlerbetrachtung: Bei der Rhesus-Faktor-Bestimmung ist ein klarer Unterscheid zwischen dem Grad der Agglutination zu erkennen. Dies kann daran liegen, dass die verwendete Blutlösung bei

Proband 2 eventuell verdünnter war als bei Proband 1. Dennoch ist auch bei Proband 2 nach längerer Wartezeit das Flockigwerden deutlich erkennbar. Quellen: -

Praktikumsskript Vorlesungsskript „Blut“ https://www.blutspendedienst.com/gegengleichgueltigkeit/beitraege/blog/un iversal-blutgruppe-null Bilder sind selbst fotografiert während des Praktikums

4. Quantitative Hämoglobinbestimung mittels Spektrophotometer

Methode: Mittels Spektrophotometer soll der Hämoglobingehalt einer Probe bestimmt werden. Um den Hb- Gehalt eines einzelnen roten Blutkörperchens zu bestimmen (MCH), muss die Erythrozytenzahl der Probe aus vorherigen Versuchen bereits bekannt sein.

Versuchsdurchführung: Das Blut der Probanden wird mit Transformationslösung vermischt und unter dem Spektrophotometer untersucht. Die Extinktion wird bei einer Wellenlänge von 546 nm gemessen.

Ergebnis: Das Spektrophotometer lieferte uns folgende Ergebnisse: Proben 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Proband 1 11 Proband 2

Absorption 0,3766 0,4224 0,3903 0,3764 0,3922 0,4023 0,3533 0,3721 0,3692 0,3912 0,3518

Hämoglobin (g/100ml) 13,6919 15,3600 14,1903 13,6865 14,2610 14,6293 12,8464 13,5279 13,4248 14,2249 12,7906

Vergleicht man die Werte untereinander, fällt auf, dass der Wert von Proband 2 relativ

niedrig ist. Dies könnte auf einen Eisenmangel hinweisen. Die Werte von Proband 1 hingegen sind im Normalbereich. Literaturwerten nach zu urteilen, liegen Normalwerte bei Frauen zwischen 12 und 16 g/100ml und bei Männern zwischen 14 und 18 g/100ml ( Quelle: Skript). Hier sieht man, dass die Mehrheit des Kurses und alle Mitglieder unserer Gruppe einen erniedrigten Hämoglobingehalt haben und man keinen deutlichen Unterschied zwischen Mann und Frau erkennen kann.

Dies liegt oftmals an verminderter Blutbildung, aufgrund von Eisen- oder Vitamin-B12Mangel. Außerdem können Gründe für einen niedrigen Hämoglobingehalt Krankheiten, wie Knochenmark- oder Niereninsuffizienz oder Morbus Crohn sein. Auch die Ernährung spielt eine wichtige Rolle beim Eisenhaushalt des Körpers. Isst man relativ wenig bis gar kein Fleisch, nimmt der Körper in der Regel weniger Eisen zu sich. Aus den Werten, die uns das Spektophotometer lieferte, ließen sich die Hämoglobingehalte der Einzeleryhtrozyten berechnen (MCH = „mean corpuscular hemoglobin“). Die Formel dafür lautet: MCH = (Hämoglobingehalt [g/100ml] x 10)/Eryhtrozytenzahl [Mill./μl] Daraus lassen sich für unsere Gruppe folgende Werte berechnen:

MCH (pg)

Proband 1 24,029

Proband 2 21,608

Literaturquellen geben einen Normalwert von 32 pg an. Abweichungen von 2 pg sind ebenfalls normal (Quelle: Skript). Demnach haben beide Probanden einen zu niedrigen MHC- Wert. Das könnte zB an Eisenmangel liegen.

5. Hämatokritbestimmung

Methode: Der Hämatokritwert gibt den Volumenanteil aller geformten Blutbestandteile am Gesamtblut

in Prozent an. Um diesen Wert zu ermitteln wird ein Kapillarröhrchen mit dem Blut eines Probanden gefüllt und 15 min bei 4000 Umdrehnungen zentrifugiert. Bei der Zentrifugation setzen sich alle Hämatokritbestandteile aufgrund ihrer Dichte und Masse am Boden des Behältnisses ab und werden vom Plasma getrennt. So kann man leicht mit einem Nomogramm den Anteil an Hämatokrit bestimmen.

Versuchsdurchführung: Den Probanden wird Blut, was vorher mit Heparin ungerinnbar gemacht wurde, abgenommen und dieses wird 15min bei 4000 Umdrehungen zentrifugiert. Danach kann der Hämatokritanteil mit Hilfe einer Ablesevorrichtung im Nomogramm abgelesen werden.

Ergebnis: Nach der Zentrifugation erhielten wir folgende Ergebnisse: Proband 1 Proband 2

40% 37%

Wenn man die Werte nun mit den Literaturwerten vergleicht, sieht man, dass beiden Probanden im unteren Normalbereich liegen, wobei Proband 2 schon an der Grenze zum Unteren Bereich liegt. Für Frauen gibt der Literaturwert einen Wert von 37 – 47% an und für Männer einen Wert von 40- 52%.

Da Erythrozyten den größten Teil des Blutes und des Hämatokrits ausmachen, kann man einen erniedrigten Hämatokritanteil mit Störungen der Erythrozytenbildung erklären. Eine andere Erklärung dafür kann eine Niereninsuffizienz und somit ein Mangel an Erythropoietin (das Hormon, das die Erythrozytenbildung steuert) sein. Eine andere Ursache für die Abweichungen von den Normalwerten kann ebenfalls eine fehlerhafte Durchführung sein. Eventuell wurde nicht richtig abgelesen, die Zentrifugation wurde nicht zureichend durchgeführt oder bei der Blutabnahme sind uns Fehler unterlaufen. Dies ist jedoch eher auszuschließen, da die Probandin 2 auch bei den anderen Versuchen ein unnormales Blutbild aufweist und somit von einer chronischen Insuffizienz oder Unterversorgung auszugehen ist

Mit den Hämatokritwerten lassen sich noch das mittlere korpuskuläre Volumen (MCV) und die mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC) errechnen. Der MCV-Wert gibt das durchschnittliche Volumen der Erythrozyten an. Der MCHC-Wert gibt

die Konzentration des Hämoglobins in den Erythrozyten an.

Die Formeln lauten: MCV = (Hämatokrit [%] x 10) / Erythrozyten [Mill./μl]

MCHC = (Hämoglobin [g/100ml] x 100% / Hämatokrit [%]

Proband 1 67,57 35,56

MCV [μm³] MCHC [g/100ml Erythrozyten]

Proband 2 62,5 34,57

Zum Schluss können wir nun eine abschließende Tabelle mit allen Blutwerten der Probanden erstellen:

Proband 1 Proband 2

Erythrozyt en [Mill./μl]

Leukozyt en [/μl]

Hämoglo Hämok rit bin [g/100ml] [%]

Blutgrup pe

MCH [pg]

MCV [μm³]

5,92

0,72

14,2249

40

B+

24,029

67,57

MCHC [g/100m l Erythroz yten] 35,56

12,7906

37

A+

21,608

62,5

34,67

6. Osmotisches Verhalten der Erythrozyten

Methode: Untersuchung der Wirkung von osmotischen Salzen und Bestimmung der Grenzkonzentration der Hämolyse und des osmotischen Resistenzgrades der Erythrozyten.

Versuchsdurchführung:

a) 1.) 2 Tropen Blut mit 5 ml isotonischer NaCl-Lösung verdünnen 2.) 1 Tropfen der Mischung auf Objektträger geben (mit Deckglas abdecken) 3.) unter dem Mikroskop betrachten und zeichnen 4.) etwas konzentrierte NaCl-Lösung an den Rand des Deckglases geben und zeichnen b) 1.) 2 Tropfen Blut in 5 ml Aqua dest. geben 2.) Blut in Wasser und in isotonischer Kochsalzlösung vergleichen 3.) Beobachtungen protokollieren c.) " Ermittlung der osmotischen Resistenz der roten Blutkörperchen" 1.) in je 5 ml 0,3-0,9 %ige NaCl-Lösung je 2 Tropfen Blut geben 2.) gut mischen und feststellen in welchen Reagenzglas Hämolyse austritt (auch unter Mikroskop möglich) d) "Bestimmung der Grenzkonzentration" 1.) ausgehend von der Konzentration, die bei der Hämolyse beobachtet wurde, wird eine 2. Verdünnungsreihe angesetzt 2.) bei der 2. Verdünnungsreihe wird NaCl-Konzentration schrittweise um 0,02% erhöht 3.) Bestimmung der Grenzkonzentration, bei der die Hämolyse gerade noch erkennbar ist

Beobachtung und Ergebnisse: a) Blut in isotonischer Lösung: Die Erythrozyten verändern ihre Form nicht. Bei der Zugabe von 5 ml isotonische NaCl-Lösung zu 2 Tropfen Blut ist zu beobachten, dass die roten Blutkörperchen sich nicht verändern, da die Lösung isotonisch ist. Das heißt dass, das Verhältnis von Wasser im Umgebungsmilieu und im Blutkörperchen gleich ist. Es herrscht also ein Konzentrationsgleichgewicht. Blut in konzentrierter NaCl-Lösung: Die Erythrozyten schrumpfen.

Bei der Zugabe von konzentrierter NaCl-Lösung ist zu beobachten, dass einige rote Blutkörperchen schrumpfen oder sogar eine Stechapfelform annehmen. Dies liegt an dem hypertonischen Milieu in dem sich die Erythrozyten befinden. Das heißt die Wasserkonzentration in den roten Blutkörperchen ist höher als im umgebenden Medium. Dadurch tritt Wasser aus den Erythrozyten aus und diese schrumpfen. Dieses Phänomen bezeichnet man als Plasmolyse.

Erythrozyt im isotonischen Medium:

Erythrozyt im hypertonischen Medium (Stechapfelform:

b) Blut in destillierten Wasser: Bei der Zugabe von destillierten Wasser ist zu beobachten, dass die roten Blutkörperchen anschwellen und platzen. Dies liegt an dem hypotonischen Milieu in dem sich die Erythrozyten befinden. Das heißt die Wasserkonzentration in den roten Blutkörperchen ist geringer als im umgebenden Medium. Dadurch nehmen die Erythrozyten Wasser auf und platzen schließlich. Dieses Phänomen bezeichnet man als Hämolyse. Blut in isotonischer Lösung: Bei der Zugabe von 5 ml isotonische NaCl-Lösung zu 2 Tropfen Blut ist zu beobachten, dass die roten Blutkörperchen sich nicht verändern, da die Lösung isotonisch ist. Das heißt dass,

das Verhältnis von Wasser im Umgebungsmilieu und im Blutkörpechen gleich ist. Es herrscht also ein Konzentrationsgleichgewicht.

c)

* *schraffiert= trüb (-> keine Hämolyse), nicht schraffiert= klar (-> Hämolyse) Es war zu erkennen, dass die Grenzkonzentration zwischen der 0,4 % und 0,5% NaCl-Lösung liegt. Da dort der Unterschied zwischen klarer und trüber Lösung erkennbar ist. In den trüben Lösungen besitzen die Erythrozyten noch ihre eigene Form, so dass das Licht gebrochen wird und die Lösung trüb erscheint. Bei den klaren Lösungen hingegen, wurden die Erythrozyten durch Hämolyse zum Platzen gebracht. Dadurch wurde der Farbstoff Hämoglobin freigesetzt und die Lösung erscheint dadurch klar und rot.

Zur genaueren Bestimmung der Grenzkonzentration wurde die 0,4 %- Lösung um schrittweise 0,02 auf 0,5 % erhöht.

*

*schraffiert= trüb (-> keine Hämolyse), nicht schraffiert= klar (-> Hämolyse) -> die hier ablesbare Grenzkonzentration liegt bei 0,45 %

Zur Bestimmung der Mischverhältnisse der 4 neuen Lösungen wurde das Mischungskreuz genutzt: Konzentration Lösung 1 x%

I(z-y)I %-Teile Lösung1 Zielkonzentration z in %

Konzentration Lösung 2 y%

Zielkonzentration 0,42 %

I(x-z)I %-Teile Lösung 2

Mischungskreuz 0,5

Mischanteile 0,42 4,2 ml NaCl-Lösung 0,8 ml dest. Wasser

0,42

0,44 %

0 0,5

0,08 0,44 4,4 ml NaCl-Lösung 0,6 ml dest. Wasser 0,44

0,46 %

0 0,5

0,06 0,46 4,6 ml NaCL-Lösung 0,4 ml dest. Wasser 0,46

0,48 %

0 0,5

0,04 0,48 4,8 ml NaCl-Lösung 0,2 ml dest. Wasser 0,48

0

0,02

Die Grenzkonzentration liegt zwischen 0,44% und 0,46%. Somit beträgt die Konzentration, bei der die Hämolyse noch auftritt, ungefähr 0,45%.

Osmotischer Resistenzgrad = NaCl-Konz. der isotonischen Lsg. – NaCl-Konz. bei Eintritt der Häm. Osmotischer Resistenzgrad = 0,9% - 0,45% = 0,45%...