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Wintersemester
Dozent: Schessl
...

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Protokoll zur Übung „Zellbiologie“ im Wintersemester 2015/16 Vorname(n)

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Protokoll zum Kurstag:

#9

Datum des Kurstages

„Abhängigkeit der Enzymaktivität der Katalase von Temperatur“

9.12.2015

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Punktabzug

Abgabe verspätet unvollständig

Text Ausdrucksfehler / mangelnde Eloquenz Grammatik mit Fehlern Orthographie mit Fehlern Fachliche Mängel Einleitung ist unvollständig / falsch / fehlt Hypothese fehlt / ist falsch Kap. „Material/Methoden“ ist unvollständig / fehlerhaft Kap. „Ergebnisse“ ist unvollständig / fehlerhaft Tabellen fehlen / sind fehlerhaft Graphiken fehlen / sind fehlerhaft Kap. „Diskussion“ fehlt / ist fehlerhaft Literatur ist falsch / unvollständig / nicht angegeben

Erworbene Punkte

sd

Protokoll zur Übung „Zellbiologie“ im Wintersemester 2015/16

1. Einleitung Enzyme

sind

Biokatalysatoren,

sie

steuern

biochemische

Abläufe

und

beschleunigen diese, indem sie die Aktivierungsenergie herabsetzen (Bannwarth et al. 2013). Hierbei wird die Gleichgewichtseinstellung zwischen dem Substrat und dem Produkt beschleunigt. Des Weiteren werden die Enzyme nicht verbraucht, sie gehen unverändert aus der Reaktion hervor, da sie ein Kreisprozess durchlaufen (Christen et al. 2016). Außer einer geringen Ausnahme sind Enzyme Proteine oder Proteine mit Cofaktoren, dabei besitzen sie eine hohe Substrat-und Reaktionsspezifität. Cofaktoren sind essenzielle anorganische Ionen oder Coenzyme, die als Cosubstrat oder als prosthetische Gruppe an das Enzym verknüpft sind (Horton et al. 2008). Katalase besteht aus vier einheitlichen Untereinheiten, die je ein Häm als prosthetische Gruppe trägt (Bannwarth et al. 2013). Dieses Enzym ist in fast allen Pflanzenzellen und tierischen Zellen enthalten, es zersetzt das toxische Zwischenprodukt Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff und dient somit der Entgiftung (Heldt und Piechulla 2015). Wie alle stofflichen Vorgänge sind auch enzymatische Abläufe von verschiedenen Faktoren

abhängig.

Die

Enzymkinetik

analysiert

die

Abhängigkeit

der

Reaktionsgeschwindigkeit unter den Faktoren: Konzentration des Substrates, des Enzymes, pH-Wert und Temperatur (Christen et al. 2016). Der Schwerpunkt hier liegt in der Temperaturabhängigkeit der Enzymaktivität, so ergeben sich die Fragestellungen:

Wie

Temperatureinflüssen

verläuft und

die

Katalaseaktivität

im welchen

unter

verschiedenen

Temperaturbereich

entsteht mehr

Sauerstoff durch die Zersetzung des Wasserstoffes? Die Untersuchung überprüft folgende Hypothesen: H1 Bei einer Temperatur von mehr als 60°C ist keine Katalaseaktivität zu erkennen, da die Katalase denaturiert. H2 Bei einer Temperatur zwischen 40-60°C ist eine geringe Katalaseaktivität zu erkennen, da ein Anteil der Katalase denaturiert. H3 Bei einer Temperatur von 0-40°C ist eine hohe Katalaseaktivität zu erkennen, da die Katalase nicht denaturiert.

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2. Material und Methoden Der Versuch wurde mit folgenden Materialien ausgeführt: Katalaser, sechs Schnappdeckelgläser, Styroporblock, Thermometer, Wasserbäder (0°C; 20°C; 40°C; 60°C; 80°C), Stoppuhr, Wasserstoffperoxid (5 %ig), Hefesuspension, Spritze, Glaspipette und Peleus-Ball. Der Katalaser wurde aus einem Stativ, zwei Klemmen, Schläuchen, einem Dreiwege-Hahn, einer Pipette und einem Ausgleichsgefäß zusammengestellt. Die Sauerstoffentstehung wurde anhand des Meniskus in der Pipette abgelesen. In der Vorbereitungsphase wurde die Hefesuspension auf 30°C erhitzt, die Deckel der Schnappdeckelgläser mit kleinen Löchern versetzt und der Katalaser auf Gasdichtigkeit geprüft. Folglich wurden Sechs Schnappdeckelgläser mit je 5 ml Hefesuspension befüllt. Diese Gläser wurden mit der Gruppennummer und mit den jeweiligen Temperaturvorgaben beschriftet und in die entsprechenden Wasserbäder gestellt. Nach 15 Minuten wurde das Glas mit der niedrigsten Temperatur (0°C) entnommen. Damit die Temperaturen der Hefesuspension sich nicht durch die Wärme der Hand verändern konnten, wurden alle Gläser im Styroporblock transportiert und untersucht. Mit der Spritze wurde 1 ml Wasserstoffperoxid aufgezogen und unter ständigem Rühren der Hefesuspension appliziert, dabei wurde die Spritze nicht entfernt. Die Stoppuhr wurde ab diesem Schritt gestartet, gemessen wurde 1 Minute lang. Darauf wurde der entstandene Sauerstoff mittels des Meniskus in der Pipette abgelesen. Dieser Vorgang wurde mit allen Temperaturen ausgeführt, dabei wurde der Meniskus immer wieder auf null zurückgestellt. Zur exakten Bestimmung der Sauerstoffentstehung, wurde 1 ml der dazugegeben H2O2Lösung abgezogen. Zusätzlich veränderte sich die Temperatur durch die Zugabe des Wasserstoffs im Reaktionsgefäß. Um die neue Temperatur bestimmen zu können, wurde die Richmann’sche Mischungsregel verwendet (Kurzweil et al. 2008). Richmann’sche Mischungsregel: c2m2 (T2 - Tm ) = c1m1 (Tm - T1 ) c1 und c2 = spezifische Wärmekapazität des Probekörpers 1 und 2 in Joule pro Kilogramm mal Kelvin [Jkg-1K-1] T1 und T2 = Temperatur der Probekörper 1 und 2 in Celsius [°C] m1 und m2 = Masse der Probekörper 1 und 2 in Kilogramm [kg]

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Tm = Mischungstemperatur in Celsius [°C] Die Formel wurde nach Tm aufgelöst, c1 und c2 konnte mathematisch gekürzt werden, da die Probekörper einen hohen Wasseranteil besaßen.

3. Ergebnisse Die folgenden Daten wurden anhand der Messungen und Formeln ermittelt: Tabelle 1: errechnete Mischtemperatur aus Hefesuspensionen und Wasserstoffperoxid

Anfangstemperatur Hefesuspension [°C]

Mischtemperatur [°C]

0

3,5

20

20,16

40

36,85

60

53,5

80

70,17

Abbildung 1: Verlauf der Katalaseaktivität unter verschiedenen Temperatureinflüssen.

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Die ermittelten Mischtemperaturen lagen zwischen 3,5°C und 70,17°C (Tab.1). In dem Temperaturbereich zwischen 3,5°C und 20,16°C wurde eine geringe Enzymaktivität erfasst, sie betrug maximal 0,7 ml O2 min-1. Eine gleichermaßen geringe Sauerstoffbildung war bei 53,5°C dargelegt. Der höchste gemessene Wert war 1,8 ml O2 min-1, bei einer Temperatur von 36,85°C. Es wurde keine Enzymaktivität bei 70,17°C erfasst (Abb.1). 4. Diskussion Die Ergebnisse verifizieren die Hypothesen. Die Katalaseaktivität steigt bis ≈ 37°C exponentiell

an

und

fällt

bei

steigender Temperatur

ab

(Abb.1).

Die

Enzymaktivitäten sind wie die alle chemischen Reaktionen von der Temperatur abhängig. Erhöht man bei einer chemischen Reaktion die Temperatur um 10°C, verdoppelt sich die Reaktionsgeschwindigkeit. Diese Abhängigkeit wird als Reaktionsgeschwindigkeit Temperatur-Regel bezeichnet. Gleichermaßen gilt in diesem Fall der Enzymkinetik, die RGT-Regel in einem Temperaturbereich zwischen 0°C und 37°C. Infolgedessen zeichnet sich die Temperaturabhängigkeit der Enzymaktivität durch eine Optimumkurve aus (Wild und Schmitt 2011). Dementsprechend

führen

Temperaturen

außerhalb

des

Optimums

zur

Denaturierung und Funktionsverlust des Enzyms. Das Temperaturoptimum hängt vom jeweiligen Enzym ab. (Bannwarth et al. 2013).

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5. Literaturverzeichnis Bannwarth H., Kremer B.P. & Schulz A. (2013): Basiswissen Physik, Chemie und Biochemie. 3. Auflage. Springer, Berlin Heidelberg. Christen P., Jaussi R. & Benoit R. (2016): Biochemie und Molekularbiologie. 1. Auflage. Springer, Berlin Heidelberg. Heldt H.W. & Piechulla B. (2015): Pflanzenbiochemie. 5. Auflage. Springer, Berlin Heidelberg. Horton H.R., Moran L.A., Scrimgeour K.G., Perry D.M. & Rawn J.D. (2008): Biochemie. 4. Auflage. Pearson Studium, München. Kurzweil P., Frenzel B. & Gebhard F. (2008): Physik Formelsammlung für Ingenieure und Naturwissenschaftler. 1. Auflage. Vieweg, Wiesbaden. Wild A. & Schmitt V. (2011): Biochemische und physiologische Versuche mit Pflanzen. 1. Auflage. Springer, Berlin Heidelberg.

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6. Anhang Tabelle 2: Enzymaktivität unter verschiedenen Temperatureinflüssen.

Inkubationstemperatur [°C] 3,5 20,16 36,85 53,5 70,17

Katalaseaktivität [ml O2 min-1] 0,5 0,7 1,8 0,7 0...