Reacción de transaminación y su reconocimiento por medio de cromatografía en papel PDF

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PrácticaReacción de transaminación y su reconocimiento por medio de cromatografía en papelIntroducción. El primer paso del catabolismo de la mayoría de L- aminoácidos, una vez han llegado al hígado, es la eliminación de los grupos α-amino, catalizada por enzimas denominadas aminotransferasas o trans...

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Práctica Reacción de transaminación y su reconocimiento por medio de cromatografía en papel Introducción. El primer paso del catabolismo de la mayoría de Laminoácidos, una vez han llegado al hígado, es la eliminación de los grupos α-amino, catalizada por enzimas denominadas aminotransferasas o transaminasas. En estas reacciones de transaminación, el grupo α-amino se transfiere al átomo de carbono α del α-cetoglutarato, dejando el correspondiente α-cetoácido análogo del aminoácido. La reacción de transaminación es probablemente una de las más difundidas en el metabolismo de los aminoácidos, su descubrimiento se debe a los científicos Braunstein y Kritzmann en el año 1938. El efecto de las reacciones de transaminación es recoger los grupos amino de muchos aminoácidos diferentes en forma de L-glutamato. Las reacciones que están catalizadas por las aminotransferasas son libremente reversibles, teniendo una constante de equilibrio de alrededor de 1.0 (∆G ≈ 0kJ/mol). Todas las aminotransferasas tienen el mismo grupo prostético y un mismo mecanismo de reacción. El grupo prostético es el piridoxal fosfato (PLP), forma coenzimática de la piridoxina o vitamina B6. El piridoxal fosfato funciona como un transportador intermedio de grupos amino en el sitio activo de las aminotransferasas. Objetivos. ★ Cuantificar la actividad de transaminasa ALAT/TGP en extracto de hígado por medio de cromatografía. ★ Elaborar una curva tipo en base a la cromatografía para su posterior lectura en espectroscopio. ★ Interpretar la actividad de transaminasa ALAT/TGP con base a Rf y lecturas de absorbancia Resultados. Tabla 1. Resultados

obtenidos del método espectrofotométrico (540nm) y aplicaciones de Ác.Glu

(sol. 20 μmoles/mL) utilizadas en el método cromatográfico.

Ejemplo del cálculo realizado para la obtención de μmoles de Glu para la curva tipo (tubo 1 a 5) Tubo 1

μmoles de Glu = 0.1 Gráfica 1. Curva tipo de Ácido Glutámico

Cálculo de μmoles de Glu del tubo P y T de acuerdo a la ecuación de la recta de la curva tipo. Y=0.591x - 0.0299 x= (Y-0.0299) / 0.591

Cálculo de μmoles de Glu del Problema donde abs= 0.283 μmoles GluP = (0.283 - 0.0299) / 0.591 μmoles GluP = 0.428 Ya que se añadieron 60 μL en cromatograma y se requieren saber los μmoles en 1 mL

0.428

μmoles Glu x x= 7.133 μmoles GluP

一 60 μL 一 1 mL (1000μL)

Cálculo de μmoles de Glu del testigo donde abs= 0.108 μmoles GluT = (0.108 - 0.0299) / 0.591 μmoles GluT = 0.132 Ya que también se añadieron 60 μL en cromatograma y se requieren saber los μmoles en 1 mL 0.132 x

μmoles Glu 一 60 一 1 mL (1000μL)

μL

x= 2.201 μmoles GluT Cálculo de las unidades transaminasa (UAT).

arbitrarias

de

Peso de hígado utilizado en proporción 1:20 p/v, entonces para 1 mL 1g x 一 1 mL

一 x= 0.05 g para 1 mL

20mL

Ya que se añadieron 60 μL 0.05g x 一 0.06 mL

一 x= 0.003 g

1mL

Por lo tanto UAT= (7.133 μmoles Glu - 2.201 μmoles Glu) / (0.003g x 1 hr) UAT= 1644 μmoles/g x hr

diferentes concentraciones y el problema, al revelar el cromatograma con sol. de Ninhidrina al 0.05% en etanol, el cual tiñe las manchas de corrimiento de color morado, permitiendo observar la presencia de glutámico debido a que el corrimiento se encontraba a una misma altura y en caso del problema se observa la separación de alanina y glutámico debido a la altura del corrimiento de las manchas que se comparan con las del glutámico en distintas concentraciones y en testigo como era de esperarse se observa una mancha de glutámico muy tenue, debido a la baja concentración de glutámico en este. A partir de esto se confirma que la reacción se llevó a cabo de forma correcta. Las muestras que utilizamos del papel Whatman, se fragmentan para cuantificar la concentración de los analitos por el método espectrofotométrico. Las muestras de ácido glutámico a diferentes concentraciones, sirvieron para realizar la curva tipo, la cual permitió comparar nuestra prueba y realizar los cálculos correctos de las concentraciones. En este caso la prueba tiene una gran concentración de ácido glutámico, lo que evidencia el efecto de la transferasa sobre la alanina y el ácido α-cetoglutarato y con esto pudimos calcular la actividad de la enzima en unidades arbitrarias de transaminasa. Conclusiones. ➢ En base a la curva tipo y distintas fórmulas se logró cuantificar la actividad de la enzima en unidades arbitrarias de transferasa. ➢ Las transaminasas son enzimas que catalizan las reacciones de transaminación, en este caso se utilizó alanina transaminasa. ➢ La transferasa, transfiere un grupo amino de un aminoácido a un a-cetoácido aceptor; dando como resultado la formación de un nuevo aminoácido y un nuevo cetoácido.

Discusión. A partir de una preparación cruda de transaminasa de hígado, se observó la reacción de la alanina y el α-cetoglutarato, bajo la acción de la enzima alanina transaminasa y se obtuvo la producción de ácido glutámico. Para confirmar lo anterior, se realizó su reconocimiento por medio de una cromatografía en papel Whatman, colocando ác. glutámico en

Pregunta extra. Hay dos transaminasas, Glutamato-oxalacetato transaminasa (GOT) y Glutamato-piruvato transaminasa (GPT), cuyos niveles en suero tienen un importante significado en el diagnóstico clínico. Se utilizan para detectar enfermedades cardíacas y hepáticas ya que la G O T abunda en

corazón y la G P T en hígado. En estados patológicos estas enzimas se liberan de las células respectivas a la sangre, donde sus niveles pueden verse muy aumentados. Por lo tanto sus niveles altos en suero pueden ser indicativos de infarto de miocardio, hepatitis infecciosa, u otros daños orgánicos. La GOT cataliza la siguiente reacción: Aspartato + α-Cetoglutarato ⇔ Oxalacetato + Glutamato

La GPT cataliza esta otra reacción: Alanina + α-Cetoglutarato ⇔ Piruvato + Glutamato

La elevación de estas transaminasas se correlaciona con el vertido a la sangre del contenido enzimático de los hepatocitos afectados, aunque el grado de la elevación enzimática puede no relacionarse con la gravedad lesional.

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