Relatório - Parasito GOTA Espessa PDF

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relatório prático sobre confecção de lâmina em gota espessa e estiraço sanguíneo....

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS CURSO DE FARMÁCIA

IZA RAUANE ROCHA SANTOS KARINE DE OLIVEIRA ALVES

RELATÓRIO DE PRÁTICA (Confecção de estiraço sanguíneo e gota espessa)

Maceió - AL 2019

IZA RAUANE ROCHA SANTOS KARINE DE OLIVEIRA ALVES

RELATÓRIO DE PRÁTICA (Confecção de estiraço sanguíneo e gota espessa)

Relatório elaborado para a disciplina de Parasitologia Clínica, ministrada pela Prof.ª Cláudia Maria Lins Calheiros, como requisito parcial para obtenção de nota da Segunda Avaliação.

Maceió - AL 2019

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 2. OBJETIVOS............................................................................................................ 3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 5. CONCLUSÃO......................................................................................................... 6. REFERÊNCIAS......................................................................................................

INTRODUÇÃO As doenças parasitárias são um problema de saúde pública, seja pela taxa de mortalidade e morbidade considerável ou pela dificuldade de detecção dos sintomas e sinais, que não são específicos. O exame médico por si só não é capaz de garantir a confirmação do parasita, sendo imprescindível que haja uma avaliação laboratorial para comprovar a infecção e identificar qual parasita a gerou. Os inúmeros métodos parasitológicos possuem vários princípios e podem ser natureza qualitativa ou quantitativa, podendo haver modificações para melhorar a identificação desses parasitas, seja de maneira direta ou indireta. O exame direto baseiase na pesquisa direta do parasita na amostra clínica, porém só apresentando alta sensibilidade na presença de parasitemia patente, sendo mais comumente utilizado na suspeita de casos agudos ou reativação da infecção. Enquanto que, os métodos indiretos são feitos em complementação aos exames parasitológicos diretos tradicionais ou casos isolados, de difícil diagnóstico, visto que se baseiam em mecanismos imunológicos. Logo, para a seguinte prática realizada foi-se eleita duas técnicas do exame parasitológico direto para ser executado: o estiraço sanguíneo e a gota espessa. Dois métodos muito utilizados na área laboratorial para a identificação de parasitas, sendo empregado sangue de coleta em tubos e um mais específico, contaminado pela dirofilariose canina (doença do verme do coração), uma antropozoonose emergente causada pelo gênero Dirofilaria. A Dirofilariose é uma infecção causada pelo parasita Dirofilaria immitis acometendo animais, principalmente cães. O parasita adulto localiza-se no coração e artérias pulmonares do seu hospedeiro definitivo e na circulação geral encontra-se a fase larval que é chamada de microfilária. Os hospedeiros intermediários, mosquitos do gênero Culex, infectam-se quando alimentam-se do sangue de um animal infectado ingerindo as microfilárias. A maioria dos animais infectados não apresenta sintomas clínicos até que a doença atinja um estágio mais avançado, facilitando assim sua transmissão para outros animais. Esta doença também é considerada uma zoonose podendo afetar os seres humanos.

OBJETIVOS O seguinte relatório tem como principal objetivo demonstrar as técnicas laboratoriais de análise parasitológica para a confecção de lâminas por estiraço sanguíneo e gota espessa, confirmando a simplicidade dos métodos e sua capacidade de demonstrar as estruturas morfológicas e demais características necessárias para identificar parasitas no microscópio óptico.

MATERIAIS E MÉTODOS

Para a confecção das lâminas foi-se utilizado amostras de sangue já coletadas em tubo com anticoagulante (EDTA), apesar do fato de também poder ser colhido diretamente por punção (parte lateral do segundo ou terceiro dedo da mão, lóbulo da orelha ou, em lactentes, o dedo grande do pé ou calcanhar). Para a preparação do estiraço ou esfregaço sanguíneo, foram necessárias duas lâminas: uma, para receber a minúscula gota de sangue (1μl aproximadamente) com identificação (01B) e outra para espalhar o sangue. Uma lanceta para espalhar o material e conta-gotas para a depositar o material e medir seu volume. 1. MÉTODO DE ESFREGAÇO SANGUÍNEO Com o auxílio de um conta-gotas foi depositada uma pequena gota de sangue na extremidade da primeira lâmina e em seguida colocado à borda da segunda lâmina (lâmina extensora), formando um ângulo de 45º com a face superior da lâmina e realizando um ligeiro movimento para trás, até encostar-se à gota de sangue. A gota irá se difundir uniformemente ao longo da borda da lâmina extensora, por capilaridade, logo após é necessário levar a lâmina extensora para frente de uma só vez, de forma que ela carregue a gota de sangue que se quer estender numa camada delgada e uniforme. Depois de realizado o processo a lâmina foi deixada para secar à temperatura ambiente em um suporte horizontal e descartado todo material restante que foi utilizado em seus respectivos locais.

Figura 1: modo de estender a gota de sangue.

Depois de realizado as primeiras etapas e a lâmina preparada estiver seca, foi-se feitas a coloração pelo método de Giemsa. O corante Giemsa é uma solução tampão de tiazina e eosinato capaz de corar elementos do sangue, especificamente os grupos de fosfato do DNA. Desse modo, após ocorrer a fixação da lâmina com álcool metílico durante 1 (um) minuto à temperatura ambiente e deixado secar, foi-se possível corar as distensões com solução de Giemsa diluída (35ml de Giemsa diluído em 500ml de água destilada), imergindo a lâmina em uma cuba de coloração de vidro por cerca de 1 (um) minuto, em seguida foi lavado a lâmina na torneira, deixado escorrer a água e colocado para secar em um suporte horizontal. Com a coloração feita de maneira correta, é possível observar os núcleos celulares em diversos tons de púrpura e o citoplasma em tons de azul a cor de rosa claro. Sendo que as lâminas de esfregaço sanguíneo conservam por maior tempo a coloração original e resistem mais ao atrito após a remoção do óleo de imersão. Para a observação no microscópio, o exame deve ser feito preferencialmente na parte mais fina (cauda) do estiraço, onde as hemácias estão dispostas em uma só camada, bordas separadas e sem sobreposição.

Fonte: arquivo pessoal. Figura 2: esfregaço sanguíneo antes de fixação pelo corante Giemsa.

Fonte: arquivo pessoal. Figura 3: lâminas em processo de secagem.

2. MÉTODO POR GOTA ESPESSA Já para a confecção da lâmina de gota espessa foi-se utilizado um sangue coletado comum e um outro de origem canina contaminado pela Dirofilaria, uma antropozoonose. Para tal preparação da lâmina é indicado utilizar sangue, preferencialmente sem anticoagulante, pois não apresenta uma boa fixação na lâmina e necessita ser feita uma coloração num prazo de até 72 horas para não ter a qualidade da amostra contaminada. Partindo disso, para o início da técnica separou-se uma lâmina limpa, deixando-a em superfície plana e horizontal, com identificação (01B), e com auxílio do conta-gotas foi aplicado 3 (três) gotas na parte central da lâmina, de maneira que fiquem próximas umas das outras, tanto para a lâmina comum como para a lâmina de dirofilariose. Em seguida, reuniu-se as gotas de maneira a formar “uma mancha” e utilizando uma lanceta espalhou-se o sangue na tentativa de formar um retângulo de tamanho e espessura adequados: aproximadamente 1,2 cm2, sendo depois deixado para secar completamente em suporte horizontal. Tal formato retangular proporciona que todas as partes da lâmina possam ser examinadas, sem perder nenhum campo de visualização.

Fonte: arquivo pessoal. Figura 4: gota espessa sanguínea (retângulo de observação).

Fonte: arquivo pessoal. Figura 5: gota espessa sanguínea - dirofilariose canina - (retângulo de observação).

A segunda etapa da confecção da gota espessa apresenta uma especificidade que não é realizado na preparação do estiraço sanguíneo, a desemoglobinização (ruptura das hemácias e das membranas dos leucócitos). Assim, após a secagem total do sangue, as lâminas foram depositadas em uma cuba e embebidas num recipiente com água num intervalo de 5 (cinco) minutos, onde as hemácias irão se romper e liberar hemoglobina, e deixadas para secar. Depois de a gota espessa estar seca, com a ajuda de uma pinça, as lâminas foram retiradas da cuba e colocadas em um suporte horizontal para secar novamente e em seguida fixadas com álcool metílico. A próxima etapa se deu depois da secagem da lâmina fixada com metanol e depositada em uma cuba de coloração de

vidro para ser corada em solução de Giemsa diluída (35 ml de Giemsa diluído em 500 ml de água destilada), por aproximadamente 5 (cinco) minutos.

Figura 6: gota espessa (desemoglobinização).

O método da gota espessa é capaz de limitar a área de observação por concentrar maior quantidade de sangue desemoglobinizado numa parte pequena da lâmina, permitindo visualizar melhor as estruturas no microscópio e quantificar os parasitas. No exame de gota espessa, o fundo deve estar claro, o mais limpo possível e branco. A cromatina e o citoplasma dos plasmócitos são facilmente visualizados respectivamente nas cores vermelho-rosado e azul. Entretanto, apesar da confecção das lâminas haverem sido feitas, não se foi possível verificar detalhadamente no microscópio os resultados finais das lâminas, assim como a de dirofilariose canina. Porém, conseguiu-se visualizar e registrar brevemente o parasita do gênero Dirofilaria no sangue canino.

Fonte: arquivo pessoal. Figura 8: microfilária encontrada no sangue de cão com dirofilariose.

RESULTADOS E DISCUSSÃO De acordo com os experimentos realizados e confirmações da literatura é comprovado à eficiência e simplicidade de duas das técnicas mais utilizadas laboratorialmente para detecção de parasitas no sangue e tecidos. Tais métodos são capazes de trazer avaliações precisas e rápidas para a confirmação de uma série de doenças parasitárias, onde se necessita apenas verificar qual melhor processo a ser utilizado em detrimento da suspeita clínica, oferecendo uma possibilidade de tratamento prévio e possibilidade de erradicação segura. Contudo, em ambas as técnicas alguns cuidados devem ser levados em consideração para que não haja perda da amostra, como a necessidade de processamento rápido pelo método da gota espessa para evitar a fixação de hemoglobina, a supercoloração e a descoloração. Já o esfregaço sanguíneo por ter menos quantidade de sangue, e este estar espalhado em uma única camada, acaba por ocupar maior área da lâmina e dificulta o encontro das hemácias parasitadas, não sendo indicado para parasitemias baixas. Entretanto, apesar de tais pontuações, os métodos continuam sendo uma das melhores fontes na identificação das estruturas morfológicas no microscópio. Diante deste fato, grande maioria das doenças parasitárias já possui sua técnica de identificação pré-estabelecida na literatura, tanto em estiraço como gota espessa.

CONCLUSÃO Foi visto que os métodos de esfregaços sanguíneos são de suma importância e possuem uma ótima eficácia para a identificação de parasitos no sangue além e um custo benefício mais interessante comparado a outros métodos catalogados, são métodos simples apesar de suas limitações. É importante que frisar que diagnóstico das infecções pelos parasitos do sangue não deve ser considerado negativo, quando somente uma amostra sanguínea foi examinada. É visto ainda na literatura que a combinação de ambos em uma mesma lâmina de microscopia pode oferecer melhores resultados. Essas preparações são indicadas para o estudo e diagnóstico das hemoparasitoses. As lâminas deverão estar quimicamente limpas, para assegurar uniforme preparação dos esfregaços e permitir sua adesão à lâmina.

REFERÊNCIAS Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de diagnóstico laboratorial da malária / Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde. – Brasília: Ministério da Saúde, 2005. NAGASHIMA, Julio Cesar. DIROFILARIOSE. Revista Científica Eletrônica de Veterinária. - São Paulo, 2009....