Replikacja, regulacja replikacji i utrzymywanie stabilności genomu PDF

Preview

Summary

Na podstawie wykładów i materiałów udostępnianych przez prowadzących...

Description

Replikacja i stabilność genomu Proces powielenia podwójnej nici DNA, samoodtwarzanie się informacji genetycznej. Cel: zapewnienie ciągłości ekspresji genów, jej regulacji. Podczas badania budowy DNA nastąpił problem natury topologicznej (skręcanie się helisy). Już Watson i Crick zauważyli komplementarność zasad oraz to, że replikacja może być semikonserwatywna. Problemy: ● możliwość zaplątania się nowo syntetyzowanych nici ● konieczność rotacji cząsteczki DNA, która musi towarzyszyć rozwijaniu się podwójnej helisy. 3 modele replikacji: ● Delbrucka – przecinania i łączenia = dyspresyjny ● Model semikonserwatywny Watsona i Cricka ● Model konserwatywny Doświadczenie Messelsona-Stahla: Prowadzono na hodowli e. coli. Hodowla prowadzona była na pożywce z „ciężkim azotem” w NH4Cl, a później przenoszono je na NH4Cl bez izotopu. Wirowano je na gradiencie z cezem. Po jednym podziale wykluczono model 3. Po dwóch wykluczono model dyspersyjny. Topoizomerazy = rozwiązanie problemu topologicznego; umożliwiają rozplatatanie nici bez rotacji ● typ I – wprowadza przecięcie w jednej nici DNA ● typ II – przecina obydwie nici. Replikacja mtDNA Replikacja typu przemieszczającej się pętli: Ma sobie miejsce startu (D-loope) do którego przyczepia się starter RNA. Najpierw replikowana jest jedna nić, a potem syntezowana jest druga.

Etapy replikacji

1. Inicjacja – rozpoznanie miejsca w obrębie cząsteczki DNA, od którego zacznie się replikacja 2. Elongacja – wydłużanie nici potomnej na matrycy rodzicielskiego DNA 3. Terminacja – zakończenie i komplementowanie nowych łańcuchów DNA

Prokaryota Miejsce inicjacji replikacji: oriC Długość: ok. 254 pz Sekwencja zawiera dwa krótkie, powtarzające się motywy: ● 9-nukleotydowy - wiązanie białka inicjatorowego DnaA ● 13-nukleotydowy - obszar topnienia helisy (powstawania oczka replikacyjnego) w wyniku przyłączenia DnaA Oczko replikacyjne + kompleks preinicjacyjny -

6 cz. DnaB = helikaza - rozrywanie wiązań wodorowych 6 cz. DnaC = białko przekaźnika - ułatwienie wiązania DnaB

Bakteryjne polimerazy: Polimeraza I - usuwanie starterów, synteza brakujących odcinków Polimeraza III - główna Bakteryjne fragmenty Okazaki – 1000 – 2000 nt. Startery: ● synteza przez prymazę ● średnia długość: od 4 do 15 nt ● W miejsce prymazy -> polimeraza 3 – po odłączeniu polimeraza 1 Ligaza = wiązania fosfodiestrowe; łączenie fragmentów Okazaki Prymo som = kompleks inicjatorowy + prymaza Replisom = (kompleks) dimer polimerazy II + prymosom Przesuwa się wzdłuż matrycy DNA Białka SSB – białka wiążące jednoniciowy DNA chronią jednoniciowy DNA przed samoistnym łączeniem się Terminacja: specyficzne sekwencje terminatorowe rozpoznawane przez białko Tus.

Drożdże Autonomicznie replikujące się sekwencje ( ARS): ● nie więcej niż 200pz i mają ● 4 subdomeny: A, B1, B2 i B3

→ A i B1 - rozpoznawane przez kompleks ORC, przyłączanie białka inicjatorowego DnaA → B2 i B3 – właściwy proces inicjacyjny; oczko i topnienie B2 - odpowiada 13-nt sekwencjom oriC (oczko replikacyjne; topnienie helisy) U ssaków występuje wiele genów, kodujących białka, o sekwencji podobnej do drożdżowych białek ORC → Proces inicjacji replikacji u drożdży jest dobrym modelem do badania replikacji w kom. ssaków

Wyższe eucaryota Region inicjacji replikacji może mieć długość nawet 8k pz. Typy domen inicjacji: ● ważniejsze - środek regionu; zachodzenie inicjacji z dużą częstością ● znaczeniu drugorzędowym - w całym regionie 8kpz, replikacja ulega inicjacji rzadziej Eukariotyczne polimerazy: ● ● ● ● ●

Alfa (jako jedyna nieaktywna egzonukleatycznie) - startery Gamma – mitochondrium delta – nić wiodąca Kappa Epsion – nić opóźniona

Eukariotyczne fragmenty Okazaki – nie przekraczają wielkości 200 nt. = około 1 pętla nukelosomu Startery: ● ● ● ● ●

brak prymaz syntezuje polimeraza alfa → potem w jej miejsce polimeraza delta odcinek o długości 8-12 nt starter mieszany RNA-DNA wycinanie starterów: endonukleaza FEN1

Fabryki replikacyjne – kompleksy enzymów replikacyjnych; zamiast replisomu Białka replikacyjne A (RPA) - zapobiegają ponownemu łączeniu się nici Czynnik replikacyjny C (RFC) - kontrola nad dołączaniem i odłączeniem enzymu z matrycy nici opóźnionej Synteza nici opóźnionej zaczyna się, gdy nić wiodąca jest już skopiowana w około 2000 pz. Terminacja: brak specyficznej sekwencji terminatorowej; terminacja przez ligację końców łańcuchów (przypadkowe spotkanie się widełek) _____________________________________________________________

Polimerazy DNA: katalizują reakcję syntezy łańcucha DNA, ZAWSZE w kierunku 5’ →3’, część posiada cechy egzonukleazy. Aktywność 3’→5’ egzonukleazy = usuwanie nukleotydów z końca 3’; z łańcucha syntezowanego Aktywność 5’→3’ egzonukleazy umożliwia usuwanie części fragmentów polinukleotydowych wcześniej dołączonych do aktualnie kopiowanej matrycy. (żadna eukariotyczna nie ma takiej zdolności) Utrzymanie stałej długości końców DNA: Powody skracania: a) Zakończenie nici opóźnionej od strony 3’ nie może być kopiowane normalnie. b) Końcowy starterowy odcinek RNA nie może być przekształcony w DNA za pomocą standardowego procesu usuwania starterów Zapobieganie: Telomery – krótkie, powtarzające się sekwencje minisatelitarne na końcach chromosomów eukariotycznych (5-15kpz) Kilkaset kopii znajduje się na końcu każdego chromosomu. U człowieka 5’TTAGGG-3’. Każdy podział: - 50-150 pz Telomeraza: ● Dyskeryna (białko) ● Łańcuch RNA = TERC (komplementarny do telomerów) ● Odwrotna transkryptaza = TERT Aktywna w komórkach macierzystych i płciowych Kompleks szelteryny: stabilność telomerów (ochrona przed fuzją) : TRF1/TRF2 Przyspieszenie skracania telomerów: ● ● ● ●

stres oksydacyjny uszkodzenia DNA choroby: cukrzyca, sercowo-naczyniowe, demencja, nowotwory, reumatyzm infekcje wirusowe (WZW C w leukocytach)

Osiągnięcie przez telomery pewnego progu krytycznego = aktywacja starzenia, zahamowanie podziałów

Regulacja replikacji: Podlega regulacji na dwóch poziomach:

- jest skoordynowana z cyklem komórkowym - zatrzymana w wyniku uszkodzenia DNA (p53)

Bakterie

Eukariota

miejsce OriC

Region inicjacji (do 8000 pz) domeny ważniejsze i mniej ważne

Prymaza Polimeraza III Polimeraza I

Polimeraza alfa Polimeraza delta Endonukleaza FEN

Replisom = prymosom (kompleks preinicjatorowy + prymaza) + polimeraza

fabryki replikacyjne

Fragmenty okazaki

1000-2000 pz

do 200 pz

Zapobieganie łączeniu nici

białka SSB

białko RPA (replikacyjne A)

Terminacja

rozpoznawane sekwencje przez białko Tus

randomowa ligacja widełek

Inicjacja...