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REPORTE 1 CARBOHIDRATOS PRÁCTICA No° 1 “Aislamiento de Carbohidratos: Lactosa” PRÁCTICA No°2 “Identificación y Cuantificación de Carbohidratos” INTEGRANTES: Gemma Azucena Nieto Becerril Mari Carmen Damián Villagómez Cesar Antonio Ruiz Estrada RESUMEN En este bloque se realizó el aislamiento de Lacto...

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REPORTE 1

CARBOHIDRATOS

PRÁCTICA No° 1 “Aislamiento de Carbohidratos: Lactosa” PRÁCTICA No°2 “Identificación y Cuantificación de Carbohidratos” INTEGRANTES: Gemma Azucena Nieto Becerril Mari Carmen Damián Villagómez Cesar Antonio Ruiz Estrada RESUMEN En este bloque se realizó el aislamiento de Lactosa, un azúcar compuesto de D-galactosa y D-glucosa, partiendo desde leche alpura semidescremada en polvo y se logró obtener su concentración; también se identificó la presencia de azúcares en distintas muestras. Esto se hizo con ayuda de pruebas como la de Benedict resultando (+) para azucares reductores todas las muestras excepto sacarosa y almidón, que dieron resultado (+) para azucares no reductores; la prueba de Molish resultó (+) para nuestra muestra problema y la prueba de Lugol que también resultó (+) para el almidón. Mediante espectrofotometría se logró determinar la absorbancia de la solución estándar de glucosa y de nuestra muestra problema; con los datos obtenidos, se hizo una gráfica de absorbancia contra concentración y se obtuvo la pendiente para calcular la concentración de lactosa con la ecuación de punto pendiente, obteniendo una concentración de lactosa de 7.4308 µg/µL

FUNDAMENTO La Lactosa es un azúcar que está formada por una molécula de glucosa y otra de galactosa unidas mediante un enlace glucosídico β (1,4). Es el azúcar de la leche (aprox. En un 5% peso/volumen en la de vaca). Es un 75% menos dulce que la sacarosa y por estar libre el carbono anomérico de la glucosa tiene carácter reductor. La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Cuando las grasas y proteínas se remueven de la leche, los carbohidratos permanecen disueltos ya que son solubles en solución acuosa. Las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico; En el punto isoeléctrico, se encuentran en equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína se encuentra en la leche en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). El caseinato de calcio tiene su punto isoeléctrico a un pH de 4.6. Es insoluble en soluciones de pH menores de este valor. EL pH de la leche es aproximadamente 6.6, por lo tanto, la caseína tiene una carga negativa a este pH y se solubiliza como una sal. Pruebas de identificación La prueba de Benedict es una reacción que es específica para azúcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los monosacáridos poseen un grupo reductor libre. Cuando un carbohidrato posee en su estructura un grupo carbonilo libre (C=O) ésta reducirá el reactivo de Benedict (Cu2+) por oxidación con los iones cobre en una solución de pH alcalino y la acción del calor (Punto de ebullición); y formará acido carboxílico Cu 1+; este se oxida y precipita en forma de Cu₂O, lo que proporciona la coloración positiva de la reacción. Al reaccionar se puede denominar como azúcar reductor. La coloración dependerá de la concentración de óxido de cobre y ésta a su vez de la reducción del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo de la concentración. La Prueba de Lugol es una reacción química usada para determinar la presencia o alteración de almidón u otros polisacáridos con una solución de yodo disuelto en una solución acuosa de yoduro de potasio. La interacción del yodo o yodo potásico con el almidón forma coloraciones azules oscuras, debido a la ocupación de los espacios

libres del glúcido, este es un glúcido alterado, al cual, sus propiedades físicas son modificadas, como la no absorción lumínica. La prueba de Selivanoff es una prueba que es específica para las cetosas. Las cetosas se deshidratan más rápidamente que las aldosas, dando furfurales. Estos se condensan con el resorcinol produciendo un complejo coloreado. Si el tiempo de ebullición se prolonga, puede dar también positivo para otros azúcares. la Prueba de Molisch es específica para determinar la presencia de carbohidratos en una muestra. Se basa en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico sobre los hidratos de carbono (monosacáridos-alta reacción y disacáridos, polisacáridos-baja reacción). En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las 12 hexosas). Estos furfurales se condensan con el α-naftol del reactivo de Molisch (reacción de Molisch) que produce un complejo de color morado. METODOLOGÍA Para la extracción de lactosa de nuestra muestra de leche semidescremada, en un vaso de precipitado de 250 ml se colocan 25 g de polvo de leche descremada, posteriormente se le adicionan 75 ml de agua caliente y se agita, la temperatura se debe ajustar a 50° C, este ajuste de temperatura es importante para mantener la caseína pues puede descomponerse a una temperatura más elevada. Para coagulación de la caseína presente en la muestra de leche, se utiliza ácido acético que en muy pequeña cantidad producirá el precipitado que se observa como leche cuajada; se adicionan 10 mL de solución de ácido acético al 10% agitando hasta observarse una coloración de blanco a amarillo transparente con apariencia grumosa. Al adicionar ácido a la leche la carga negativa de la cara externa de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra se precipita. Posteriormente la solución obtenida debe ser filtrada a gravedad usando tres capas de gasa, para facilitar la separación de la caseína cuajada de la solución que contiene la lactosa. Se coloca el residuo líquido que contiene la lactosa en un matraz de 250 mL y se adiciona 2 g de CaCO₃ en polvo, se agita y se hierve la suspensión por 10 minutos, una vez transcurrido el tiempo se filtra la suspensión al vacío usando un matraz Büchner para eliminar el residuo sólido. En un vaso de precipitado se adiciona el líquido obtenido en la filtración y se adiciona agua destilada hasta llegar a un volumen de 30 mL y se facilite así la ebullición, que se realiza usando la parrilla eléctrica y siempre agitando para evitar proyecciones. Una vez transcurrido un lapso de 10 minutos se agrega 125 mL de etanol al 96% (V/V) y se filtra la mezcla al vacío; el etanol se utiliza como solvente, pues la lactosa es poco soluble en éste. Finalmente se transfiere el líquido obtenido en la filtración a vacío a un vaso de precipitados y se deja en reposo durante 24 horas, para una vez precipitada la lactosa, obtener separándola por filtración a vacío, se pesa el producto obtenido y se calcula el porcentaje de lactosa obtenida durante la realización de esta práctica. Para la identificación y cuantificación de carbohidratos se realizan varias pruebas para la determinación del tipo de carbohidrato y la cuantificación del mismo mediante su concentración, La práctica se divide en dos partes. La parte A, en la que se realiza la identificación de azúcares mediante diversas pruebas. Las pruebas 1 y 2 consisten en la identificación de azúcares reductores y no reductores. Para ello se colocan 0.5 mL de cada una de las soluciones de azúcar, incluyendo la solución de lactosa, se añadieron 0.5 ml de la solución de Benedict a cada muestra, y se observó si había formación de un precipitado o cambio de color, si ningún cambio de estos fue observado, se calentaron los tubos en un baño de agua hasta ebullición, se observaba de nuevo y si existía un precipitado color rojo, amarillo, o verde amarillento la prueba era positiva e indicaba la presencia de un azúcar reductor. Pero si no se observaba lo anterior se adicionan 10 gotas de HCl diluido y se calienta de nuevo a baño María durante un periodo de 5 minutos, se adiciona 0.5 mL de solución alcalina, y se repite la prueba de Benedict que siendo positiva nos indica que sí son azucares no reductores. La siguiente prueba fue la de Selivanoff, la cual consiste en la adición de 1 mL de reactivo de Selivanoff a 1 mL de solución de azúcar, se lleva a ebullición por un minuto en un baño maría, para posteriormente observar si existe el cambio a un color rojo o la formación de un precipitado rojo, si esto ocurre la prueba resulta positiva y por tanto confirma la presencia de cetosas. Esta prueba no fue realizada, pero es importante conocer su utilidad.

La quinta prueba consistió en la identificación de almidón de la muestra, en la cual, en un tubo de ensaye se colocan 3 mL de la solución de almidón, se adicionan 3 gotas de solución de Lugol y se observa el cambio de coloración de transparente a azul, se lleva a calentamiento evitando la ebullición hasta observar el cambio de color de azul a transparente y se dejó enfriar hasta observar el cambio de color de nuevo a azul. Finalmente, para la prueba del reactivo de Molish, se colocan en un tubo de ensayo 0.5 mL de la solución de azúcar problema y se adicionan 2 gotas de α-naftol al 1% y se mezcla, con precaución se adiciona por la pared del tubo, 1 mL de ácido sulfúrico concentrado evitando que se mezclen para poder observar la formación de una capa debajo del azúcar, para producir la formación de un anillo color negro arrojando así que la prueba resulta positiva. Esta formación del anillo color negro se produce por la deshidratación del azúcar y la reacción con el α-naftol. En cuanto a la parte B, se llevó a cabo la cuantificación de azúcares. En la que se utiliza una solución de 0.5 mg de lactosa en un mililitro de agua destilada como muestra problema, y muestras de una solución estándar de glucosa (1 mg/ml). Se preparan dos series de tubos con las cantidades marcadas en la tabla de volúmenes. Se mezcla con ayuda de un bórtex y se colocan en baño María por 15 minutos. Posteriormente se adiciona a cada tubo 1.2 mL de agua destilada y finalmente se transfieren 200µL de cada tubo a una placa de 96 pozos, se avisa al profesor y se lleva a el aparato de espectrofotometría visible para medir la absorbancia; una vez obtenidos los datos, deben ser graficados para determinar la concentración de azúcar reductor presente en la solución problema (µg). Resultados y discusión

g lactosateórica en 25 g de producto

Aislamiento de Lactosa Mediante técnicas sencillas de laboratorio y aprovechando sus propiedades fisicoquímicas se realizó el aislamiento de la lactosa contenida en la leche semidescremada en polvo de la marca Alpura, la cual contenía la siguiente información n

g lactosateórica=

:

(46.9 g)(13.225 g) =6.202 100 g g

Cantidad teórica de lactosa =6.202 g Cantidad experimental de lactosa=.3.374 Rendimiento=

g

lactosa experimental (100) lactosa teórica

3.734 g (100) 6.202 g Rendimiento=¿ 54.40% Rendimiento=

Identificación y Cuantificación de carbohidratos PARTE A Prueba 1. Identificación de azúcares reductores

Se realizaron los cálculos del rendimiento teórico del aislamiento de lactosa:

100 g producto → 46.9 g carbohidratos 25 g producto → X carbohidratos Xcarbohidratos=

25 g de Producto [ 52.9] 100

13.225 g

=

Siete tipos de carbohidratos fueron sometidos a la prueba de Benedict, la formación de un precipitado rojo, amarillo o verde amarillento indica la presencia de un azúcar reductor. Todos fueron sometidos a calentamiento ya que no precipitaron con sólo agregar el reactivo de Benedict, se muestran los resultados en la tabla1. Tabla 1. Identificación de azúcares reductores Azúcar Observación Resultado Positivo Glucosa Rojizo c/precipitado. Positivo Fructosa Rojizo c/precipitado. Positivo Galactosa Rojizo c/precipitado.

Lactosa Sacarosa Almidón Miel

Rojizo c/precipitado. Azul sin precipitado Azul sin precipitado Rojizo

Positivo Negativo Negativo Positivo

Prueba 2. Identificación de azúcares no reductores. De los azúcares que dieron negativo a la prueba uno (sacarosa y almidón) fueron tomadas otras muestras de 0.5 mL a las cuales se les agregó HCl y se calentaron durante 2 minutos, se les realizó de nuevo la prueba 1 y se neutralizaron, ambos azúcares son no reductores. Los resultados se muestran en la tabla 2.

c/precipitado. Rojizo c/precipitado.

Muestra Problema

Positivo

La color azúcar r un grupo

medida favorabl

Tabla 2. Identificación de azúcares no reductores Azúcar Observación Resultado Almidón Naranja con Positivo precipitado Sacarosa Naranja con Positivo precipitado

Identificación de almidón. Para la cuantificación de almidón, se observó que el cambio de coloración ocurrió al agregar el Lugol a la solución de almidón al 1%, a temperatura ambiente debido a que se forman cadenas de poli yoduró a partir del yodo presente en la solución de Lugol, la amilosa que compone al almidón el cual tiene una estructura lineal forma hélices donde se juntan las moléculas de yodo formando así un color azul. El complejo formado es sensible a la temperatura, ya que si calentamos el tubo de ensaye el color desaparece esto debido a que en las espiras de almidón se produce una modificación y el yodo se libera

promedio

µg

0 0.042 0.067 0.1665 1.0595 1.295 1.523 1.8765 0.2663

0 3 5 10 20 40 60 80 2*

Prueba de Molish

*la concentración de nuestra muestra problema no entraba dentro de nuestra grafica por lo cual no se pudo determinar la concentración de la antes mencionada por lo que para fines de poder hacer el cálculo la concentración se dividió entre 10. La absorbancia real por 20 µg es de 2.663.

Una prueba de Molish se dice positiva si hay una formación de un anillo oscuro.

Se hizo una gráfica con los valores de la concentración de la glucosa (µg) en el eje x, contra la absorbancia en eje y.

Aquí el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos del azúcar y la deshidratación a hidroximetilfurfural. Estos furfurales se condensan con el αnaftol del reactivo de Molisch, lo cual produce un complejo de color morado, lo cual indica que hay presencia de carbohidratos en la muestra, esta prueba resultó positiva para nuestra muestra problema.

Los valores siguieron un patrón por lo que se pudo generar una recta, después se obtuvo la pendiente para calcular la concentración de lactosa despejando de la formula.

m=

y 2− y 1 x 2− x 1

m=0.0246 PARTE B

y=mx + b

Se cuantificó la cantidad de glucosa en una muestra problema con espectrofotometría, para este procedimiento es muy importante cuidar las concentraciones, toda

x=

y−b m

x=

0.2663−0.0835 0.0246

x=7.4308 µg

m=pendiente b=ordenada y=promedio de los valores de absorbancia x=concentración de lactosa

Donde:

Referencias 

Silvia Quesada Mora. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica. San Jose. Costa Rica.: 1era Edición, Ed. EUNED. Pp.87-98



Eva Irma Véjar Rivera. (2005). Prácticas de Bioquímica Descriptiva. Hermosillo. Sonora: Ed. UniSon. Pp.133-141



Georgina Gómez S.,Jaime Fornaguera T. (2004) Bioquímica: la Ciencia de la Vida. 1era Edición. Editorial EUNED. Cap. 4. Pp. 166-171



Pilar Roca, Jordi Oliver, Ana María Rodríguez. (2003) Bioquímica: técnicas y métodos. 13ª Edición. Editorial Hélice. España. Pp.271-278, 285-288....