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Universidad Nacional Autónoma de MéxicoFacultad de Estudios Superiores ZaragozaLaboratorio de Ciencia Básica IIIREPORTE 2: “EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍADE UNA MUESTRA DE ESPINACA”Alumnas:Gutiérrez Valencia KarenGuzmán Valencia Diana KarenGrupo: 3303Profesora: Ma. Estela Jiménez Encarnación23 /11/LABOR...

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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Laboratorio de Ciencia Básica III

REPORTE 2: “EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍA DE UNA MUESTRA DE ESPINACA”

Alumnas: Gutiérrez Valencia Karen Guzmán Valencia Diana Karen

Grupo: 3303

Profesora: Ma. Estela Jiménez Encarnación

23/11/2020

LABORATORIO DE CIENCIA BÁSICA III UNIDAD 2: CROMATOGRAFÍA Y CRISTALIZACIÓN. PRÁCTICA 2: “EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍA DE UNA MUESTRA DE ESPINACA” RESUMEN: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ¿Cómo se llevó a cabo la cromatografía y extracción del pigmento de la espinaca?¿Fueron notables las tonalidades de nuestro pigmento? DELIMITACIÓN DEL PROBLEMA Podemos definir la extracción como la separación de un componente de una mezcla por medio de un disolvente. En la práctica, la extracción suele emplearse para separar un compuesto orgánico de una solución o suspensión acuosa. El proceso consiste entonces en agitar la solución o suspensión acuosa con un disolvente orgánico inmiscible en agua y permitir que las capas se separen. Los diversos solutos presentes se distribuyen entonces entre las capas acuosa y orgánica según sus solubilidades relativas. Así, las sales inorgánicas, que son casi totalmente insolubles en los disolventes orgánicos comunes de extracción, aparecerán exclusivamente en la capa acuosa, y los compuestos orgánicos no ligantes al hidrógeno, como los hidrocarburos y sus derivados halógenos, que son esencialmente insolubles en el agua, en la capa de disolvente orgánico. Por lo general, una sola extracción bastará para efectuar una separación limpia entre los compuestos de estos dos tipos. En un proceso de separación cromatográfica representativa, la mezcla puede colocarse en la columna como solución en éter de petróleo, el cromatograma desarrollado con benceno y las diferentes bandas eluidas con etanol. Por supuesto, se obtienen matices más finos de desvelado y elución utilizando disolventes mixtos apropiados, como el éter de petróleobenceno, el benceno-etanol, etc. Aparatos. En su forma más simple, los dos únicos aparatos necesarios para la cromatografía son: 1) un tubo de vidrio extraído en su extremo inferior, con un tapón de lana de vidrio colocado en la parte superior de la constrictora que su columna de adsorbente puede funcionar como su propio depósito, o bien un depósito adicional en la parte superior del tubo. Los refinamientos del aparato pueden incluir un disco de porcelana perforada o de vidrio sinterizado sellado en el tubo justo por encima de la constricción, la presencia de una llave de paso en la porción extraída del tubo justo por encima del segmento que encaja en el matraz del filtro a través del tapón, y el uso de juntas de vidrio esmerilado en todo. Si la columna de adsorbente debe ser empujada fuera del tubo y cortada en segmentos después del desarrollo del cromatograma, es conveniente utilizar un tubo que no tenga constricción; el tapón de lana de vidrio y la columna de adsorbente pueden mantenerse en su lugar mediante una gasa de cobre doblada sobre el fondo del tubo o mediante el uso de una columna de dos piezas, equipada con juntas de vidrio esmerilado, en la que hay una constricción y un disco en la parte inferior y todo el adsorbente se mantiene en la parte superior.

INTRODUCCIÓN ●

Extracción La extracción con disolventes es la técnica de separación de un compuesto a partir de una mezcla sólida o líquida, aprovechando las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en un disolvente adecuado. Constituye una de las técnicas de separación de compuestos más utilizada en el laboratorio químico. En un laboratorio químico, es frecuente utilizar mezclas complejas de diferentes compuestos. Casi siempre que se lleva a cabo una reacción de preparación de un compuesto determinado, es necesario separar este producto de la mezcla de reacción donde puede haber subproductos formados en la reacción, sales u otras impurezas. Así, en el laboratorio químico la separación y la purificación del producto deseado son tan importantes como la optimización de su síntesis, con lo cual, además de mejorar las condiciones de reacción buscando un elevado rendimiento de formación del producto deseado, se tienen que plantear procesos eficientes de separación que permitan una recuperación máxima del producto a partir de la mezcla de reacción. La extracción es una de las técnicas más útiles para hacerlo.

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Fundamento teórico La separación de un compuesto por extracción se basa en la transferencia selectiva del compuesto desde una mezcla sólida o líquida con otros compuestos hacia una fase líquida (normalmente un disolvente orgánico). El éxito de la técnica depende básicamente de la diferencia de solubilidad en el disolvente de extracción entre el compuesto deseado y los otros compuestos presentes en la mezcla inicial. El principal objetivo de la extracción es separar selectivamente el producto de una reacción, o bien eliminar las impurezas que lo acompañan en la mezcla de reacción, gracias a sus diferencias de solubilidad en el disolvente de extracción elegido.

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Cromatografía de adsorción: La cromatografía de adsorción o líquido-sólido, es la forma clásica de cromatografía de líquidos. La adsorción se lleva a cabo cuando hay una concentración más alta en la superficie de un sólido que en la solución circundante. La adsorción se refiere al enlace de una sustancia a la superficie de otra. Generalmente los adsorbentes usados en cromatografía son el carbón mineral, el gel de sílice, y la alúmina.

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Cromatografía de partición: La mayoría de las sustancias tendrán distinta solubilidad en diferentes solventes. Si una sustancia se pone en contacto con dos solventes que no se mezclan entre sí, se distribuirá entre los dos solventes en relación a su solubilidad en cada uno. Se llama efecto de partición a la distribución de un soluto entre dos o más solventes que no se mezclan. El solvente o el líquido que es atrapado por el medio del sostén sea este

papel, gel, sílice o alúmina, se llama fase estacionaria. Al solvente revelador se le llama fase móvil. ●

Cromatografía en capa fina: Es una técnica analítica y tiene como objetivo el análisis de una mezcla de componentes. En la cromatografía en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de un adsorbente (como por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa) depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio, o una lámina de aluminio o de plástico.

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Procedimiento: Una placa de CCF es una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una capa delgada de un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina). Se deposita una pequeña cantidad de la muestra problema en disolución en un punto en la parte inferior de la placa. Entonces la placa se introduce en una cubeta cromatográfica, de forma que sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. Este líquido o eluyente es la fase móvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad. A medida que el eluyente pasa por el lugar donde está la mancha de la mezcla problema se establece un equilibrio entre las moléculas de cada uno de los componentes en la mezcla que son adsorbidas y las que se encuentran en disolución.

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Visualización de las manchas Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista. Si no es así, hay varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente de la mezcla.

1. Utilizar luz ultravioleta para observar la placa. Normalmente se adiciona un colorante fluorescente al adsorbente, de forma que la placa sea fluorescente en todas partes excepto donde haya una mancha correspondiente a un compuesto orgánico. 2. Utilizar reveladores, por ejemplo, vapores de yodo que es un reactivo inespecífico. 3. Emplear reactivos específicos para desarrollar coloración en las manchas. Esto se puede hacer sumergiendo la placa de CCF en una disolución que los contenga o en forma de spray. En principio, los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su adsorción, de forma que unos componentes se desplazarán más que otros. Cuando el eluyente llega a la parte superior de la placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de la mezcla se visualizan.

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Cálculo del factor de retención Rf Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el valor de Rf (factor de retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la placa. Cada compuesto tiene un Rf característico que depende del disolvente empleado y del tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente. De esta manera se puede ayudar a identificar un compuesto en una mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando se hacen eluir en la misma placa de CCF). Rf=distancia recorrida por el compuestodistancia recorrida por el disolvente

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Cromatografía en columna Es una técnica de purificación, puesto que permite aislar los compuestos deseados de una mezcla. Los principios de la cromatografía en columna son similares a los de la cromatografía en capa fina. La principal diferencia es que la fase móvil en la cromatografía en columna se desplaza hacia abajo, mientras que en la cromatografía en columna el disolvente asciende por la placa. La cromatografía en columna se utiliza más a menudo que la cromatografía en columna para separar cantidades relativamente grandes de compuestos. Con la cromatografía en columna es posible recoger muestras puras de los compuestos separados y realizar pruebas adicionales sobre ellos. En este experimento, el flúor y la fluorenona se separarán mediante cromatografía en columna utilizando alúmina como adsorbente. Dado que la fluorenona es más polar que el fluoreno, la fluorenona se adsorberá más fuertemente a la alúmina. El fluoreno se eluirá de la columna con un hexano de disolvente no polar, mientras que la fluorenona no se desprenderá hasta que se ponga un disolvente más polar (30% de acetona - 70% de hexano) en la columna. La pureza de los dos compuestos separados será probada por la TLC y los puntos de fusión.

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Procedimiento La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3)) La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su separación. Así, de manera similar a otros tipos de cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la

columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes. La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten más eficientemente con las moléculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más polares, rápidamente a través de la columna. Si el disolvente es muy polar la elución será muy rápida y generalmente habrá poca separación de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo tanto, la elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separación. ●

Análisis de los eluatos de la columna Si los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados, el progreso de la separación se puede monitorizar visualmente. No obstante, a menudo los compuestos que deben ser aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente pequeñas fracciones de eluatos en tubos rotulados y la composición de cada fracción se analiza por cromatografía en capa fina. Una vez identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se reúnen, se elimina el disolvente y se analiza la identidad de los componentes por métodos espectroscópicos.

Eluyentes usados comúnmente en cromatografía en columna y capa delgada en orden creciente de polaridad. 1. Hexano 2. Éter de petróleo 3. Benceno 4. Tolueno 5. Éter etílico 6. Cloroformo 7. Acetato de etilo 8. Cloruro de metilo 9. Dicloroetano 10. Acetona 11. Etanol 12. Metanol ● Preparación del capilar para aplicar la muestra en la cromatoplaca. Se le aplica calor para así poder romperlo cuidando que quede un orificio no muy grande. ●

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¿Por qué es necesario que la cámara de elusión esté saturada con los vapores del eluyente? Porque así será más fácil el arrastre de los pigmentos y no se secará la placa.

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Eluyente Solvente que se usa en técnicas de cromatografía para extraer un compuesto que se quiere separar de otra fase.

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Eluato La sustancia que se separa o sale de la columna después de cada extracción.

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Elución fraccionada Aparato de elución fraccionada electroforético tiene una columna con una rotación conjunta de sello en el que un delgado chorro de elución búfer es dirigido a través de la luz de la columna electroforética en una dirección perpendicular a la de migración electroforética. El contenido de la columna se gira en relación con el jet estacionario o se gira el jet con respecto a la columna. El sistema puede emplear electroforesis en solución libre o en columnas empaquetadas.

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Adsorción Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidos en la superficie de otra sustancia o material.

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Partición La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil.

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Elución Se produce por el flujo de una fase móvil a través de la fase estacionaria.

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Adsorbente Es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente presente en corrientes líquidas o gaseosas. Se caracteriza por una alta superficie específica y por su inercia química frente al medio en el que se va a utilizar.

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Actividad del adsorbente El nivel de actividad de la adsorción depende de la concentración de la sustancia en la solución, la temperatura y la polaridad de la sustancia.

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Afinidad por el adsorbente Es que la sustancia ceda a la capacidad de capilaridad del adsorbente y eluya a través de él.

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Clasificación de la cromatografía en función de su fase estacionaria

Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase móvil

Líquido Gas

Clasificación Líquido-líquido: partición Líquido-sólido: adsorción, cambio iónico, exclusión, afinidad. Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS)

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Función de la fase móvil y cómo se lleva a cabo la separación en la cromatografía de adsorción Su función es eluir los componentes de la mezcla a separar a través de la fase estacionaria. La cromatografía de adsorción se lleva a cabo mediante el uso de una fase estacionaria donde se observará la elución de los componentes de la mezcla, los cuales serán eluidos por el disolvente, que es la fase móvil.

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Preparación de la papilla para la cromatografía en capa fina. Se machaca con ayuda de un mortero y pistilo hasta hacer polvo la sílica, luego se añade el disolvente. También se puede hacer en un vaso de precipitados y con una varilla de vidrio, agitando constantemente hasta formar la papilla.

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Activación de la placa Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que actúa como una impureza y evita una buena separación. La magnitud de calor depende del tipo de separación que se requiere para compuestos hidrófilos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son generalmente suficiente; para los compuestos hidrofóbicos o no polares es necesario un calentamiento más intenso. Las placas de óxido de aluminio y de gel de sílice con adhesivo requieren ser secadas al aire durante aproximadamente 30 min. Y después ser activadas en un horno a 100°C alrededor de 30 min. Las placas de celulosa deberán secarse al aire libre durante 30 min. y activarse al horno durante 10 min. a 105°C.

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Relación entre la cantidad de adsorbente y las dimensiones de la columna para una mezcla. Entre más grande sea una columna, más adsorbente se necesitará, esto para observar mejor la separación de los componentes; además de necesitar más disolvente para continuar la elución y evitar la sequedad del sistema.

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¿Cómo debe de ser la polaridad del eluyente al empacar una columna? La polaridad del eluyente debe ser mayor.

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¿Cuándo se usa el Rx en cromatografía en capa delgada? Cuando no se cuenta con un compuesto con polaridad conocida, y por lo tanto elusión conocida, que se pueda usar como referencia en la C.C.D.

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¿Qué significa la obtención de Rx igual a uno? Que el compuesto y el eluyente tienen la misma polaridad, incluso hasta mayor la de este último.

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Frente del eluyente en cromatografía en capa delgada. Es la línea donde acaba la elusión, si se rebasa dicha línea se corre el riesgo de que los componentes separados se esparzan a lo largo de la parte posterior de la placa.

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Control de la salida de los componentes en una cromatografía en columna Se controla con la llave de la bureta, se va colocando los distintos pigmentos en tubos de ensayo, a los que se les denominará como fracciones.

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Diferencia existe entre cromatografía en capa delgada analítica y cromatografía en placa preparativa La preparativa se emplea generalmente para elegir un eluyente o mezcla de eluyentes ideal para cromatografía en columna. La analítica ya cuenta con un eluyente ideal y registra Rx, es decir, se analiza la elusión de los componentes para arrojar un valor numérico final.

OBJETIVOS El objetivo de esta práctica principalmente fue entender y conocer cómo se lleva a cabo la extracción de los pigmentos de un producto vegetal (espinaca), por medio de la maceración. Para posteriormente conocer los componentes que este contiene, con una separación de sus compuestos orgánicos por medio de una cromatografía comparativa a través de la cromatografía en columna y la cromatografía en capa fina. HIPÓTESIS De acuerdo a la teoría vista en clase establecimos que antes de llevar a cabo la cromatografía se deben extraer los pigmentos que le dan color a nuestro vegetal (clorofilas, carotenos, xantofilas, antocianinas y ficobilinas) por medio de un disolvente. En este caso lo llevaremos a cabo con una muestra de espinaca.

Después de esto debimos de llevar a cabo nuestra cromatografía por medio de tres procesos: cromatografía en capa fina (para realizar nuestras pruebas de elución) → cromatografía en columna → cromatografía en capa fina (esta vez para utilizarla de manera comparativa), esta última para corroborar que nuestro proceso de cromatografía en columna se llevó a cabo correctamente. VARIABLES DEPENDIENTES ● Valor de Rf ● Pigmentación cada prueba elución

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