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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Bioquímica general

Practica: Curva tipo de azúcares reductores Integrantes: Enríquez Pérez Efrén Ernesto y Prieto Gamboa Diana Jimena Introducción Resultados Las enzimas son altamente específicas y su actividad puede modificarse por diferentes factores tales como temperatura, pH, concentración de enzima, concentración de sustrato, inhibidores, etc. La cinética enzimática comprende el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y de las condiciones que las modifican, así como los mecanismos de reacción. Una curva de calibración o curva tipo es la representación gráfica de valores de absorbencia en función de concentraciones conocidas de un analito. Este experimento tiene por objeto obtener una curva de calibración, mediante la cual se puedan transformar las lecturas de absorbencia obtenidas en los experimentos de cinética enzimática, en micromoles de azúcar reductor y así obtener la actividad de la enzima invertasa en unidades Internacionales (UI).

Objetivos  Analizar algunos factores que modifican la velocidad de la reacción catalizada por la invertasa y caracterizar de esta manera a dicha enzima.

Tabla 1. Resultados para la curva tipo de azúcares reductores

Tubo

Blanco 1 2 3 4 5

mL Glucosa 0.005 M/ mL Fructosa 0.005 M 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.0

Azúcar reductor (μmoles/3.5 mL) 0 1 2 4 8 10

Tabla 2. Valores de glucosa +fructosa en μmoles/3.5 mL

Glucosa ( 0.005 M )+Fructosa ( 0.005 M )=0.01 M 0.01 M= 1000 mL



Obtener una curva de calibración para transformar las lecturas de absorbencia.



Obtener la actividad de la enzima invertasa.

Si hay 0.01 mol por cada 1000 mL de solución de azúcar reductor, entonces por cada 0.1 mL de solución hay 1x10-6 moles de azúcar reductor. Por lo tanto:

μmoles de azúcar reductor 10 1 Vo= =0.1 mL 10 Vo=

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0.01M ----- 1000 mL X= 1x10 ----- 0.1 mL

Vo=

0.5

X= 1x10-6 = 1 μmol/3.5 mL

2 =0.2 mL 10

Absorbencia

-6

f(x) = 0.06 x + 0.04 R² = 0.96

0.4 0.3 0.2 0.1 0

0

2

4

6

8

μmoles/3.5 mL

0.01M ----- 1000 mL X= 2x10-6 ----- 0.2 mL

Vo=

Figura 1. Curva tipo de azúcar reductor

X= 2x10-6 = 2 μmol/3.5 mL

4 =0.4 mL 10

0.01M ----- 1000 mL X= 4x10-6 ----- 0.4 mL

Vo=

X= 4x10-6 = 4 μmol/3.5 mL

8 =0.8 mL 10

0.01M ----- 1000 mL X= 8x10-6 ----- 0.8 mL

Vo=

X= 8x10-6 = 8 μmol/3.5 mL

10 =1.0 mL 10

0.01M ----- 1000 mL X= 1x10-5 ----- 1.0 mL

X= 1x10-5 = 10 μmol/3.5 mL

Según la ley de Lambert-Beer, la absorbencia es igual al producto de la capacidad que tiene la materia para absorber luz por el paso de luz ; la concentración del analito, como la absorbencia y el paso de luz son constantes (las mediciones de absorbencia se hicieron en el mismo tipo de analito), se establece que la absorbencia es proporcional a la concentración de analito, en este caso a la concentración de los azúcares reductores Discusión Según las imágenes otorgadas por el profesor, se observa la presencia de color cuando estos se sometían a

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calentamiento a baño maría, el color va dependiendo de la cantidad de azúcar reductor (glucosa-fructosa) que se le haya adicionado. La sacarosa es un disacárido no reductor, que se oxida con facilidad debido a que sus átomos de carbono anoméricos están unidos a un enlace glucosídico. El ácido 3,5dinitrosalicílico reacciona solo con azúcares reductores , cuando la sacarosa se hidroliza se libera la glucosa y fructosa (ambos son azúcares reductores) que reaccionan con 3,5 DNS a una temperatura dada durante un tiempo marcado para generar coloración y posteriormente ser observado en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. Además de permitir el desarrollo de color, el DNS proporciona el nivel de pH necesario para que las reacciones de óxido-reducción se lleven a cabo. Cuando se añade el 3,5 DNS a la glucosa + fructosa, ocurre una reacción de óxido-reducción en la cual el DNS es reducido por la glucosa a ácido 3-amino5-nitrosalicílico, mientras que la glucosa se oxida a ácido D-glucónoico.

Preguntas extra 1.-Colocar la reacción general y el equilibrio ceto-enolico:

Conclusiones   

A mayor cantidad de μmol de azúcar reductor, mayor es la absorbencia reflejada. El ácido 3,5- dinitrosalicílico nos permite observar el poder reductor de los azúcares. Para medir la cinética de una reacción resulto ser más factible medir la cinética enzimática de la invertasa la cual nos proporcionó datos cuantificables para obtener nuestra curva tipo.

Bibliografía 

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Lehninger, A.L. (1993). “Principios de bioquímica” 2da edición. Ed, Worth Publiserhs, Inc. PP. 138146. J.M. García-Segura, J.G. Gavilanes, A. Martínez del Pozo, F. Montero, M. Oñaderra y F. Vivanco.(1999) Técnicas Instrumentales de Análisis en Bioquímica. Editorial Síntesis.1ra edición , pag 129-132.

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