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Escuela de Ciencias de la Salud Universidad del Valle de México

Reporte de la práctica 1: Exudado Faríngeo. Francisco González Luis Angel, Galán Aguilar Melissa, García García Diana Alejandra, Hernández Hernández Oscar Hilario, Velazco Villalvazo Dalia del Carmen. Asignatura: Microbiología Clínica. Licenciatura en QFBT Periodo 2022-4 Docente: Porras Ramírez Javier. Fecha de entrega: 08 de marzo de 2022. RESUMEN Un exudado faríngeo es una prueba diagnóstica que se obtiene a partir de las células de la faringe y es de utilidad para detectar microorganismos que puedan causar una infección, posterior a la toma de muestra, esta se siembra en medios de cultivo que contienen fuentes de carbono, nitrógeno y vitaminas que estimulan su crecimiento y brindar un tratamiento adecuado al paciente acorde al m.o presente. Para la realización de esta práctica se utilizaron los medios de cultivo; agar sangre, agar casero, agar sal y manitol, agar nutritivo y agar Eosina Azul de metileno, con ello se pudo observar el crecimiento de las bacterias y las diferentes reacciones de hemólisis que pueden llevar a cabo. Se llevaron a cabo de igual manera, pruebas de caracterización como la prueba de catalasa y oxidasa, que determinan la presencia de enzimas en las bacterias y su actividad al catalizar ciertas reacciones, para la identificación de las bacterias obtenidas se llevaron a cabo tinción de Gram y tinción ZiehlNeelsen, con ello se observó la morfología microscópica de las colonias, obteniendo cocos Gram positivos semejantes a los Estreptococos y bacilos Gram negativos, se analizaron el tipo de hemólisis que produjo la bacteria en agar sangre y se identificó que producen hemólisis de tipo beta. De igual manera se observó que todas las tinciones de Ziehl- Neelsen tuvieron un resultado negativo, de lo contrario el paciente podría presentar enfermedades como la tuberculosis. Palabras clave; Exudado faríngeo, Agar sangre, Tinción de Gram, catalasa, oxidasa, Estreptococos. INTRODUCCIÓN Un cultivo de exudado faríngeo es una prueba para detectar microorganismos que pueden causar una infección. Se añade una muestra de células de la faringe a una sustancia que estimula la multiplicación de los microorganismos. Si no hay una multiplicación de microorganismos, el cultivo

es negativo. Si hay una multiplicación de microorganismos que pueden causar una infección, el cultivo es positivo. El tipo de microorganismo puede identificarse con un microscopio o pruebas químicas. A veces, se hacen otras pruebas para determinar cuál es el

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medicamento adecuado infección. (North, 2019)

Escuela de Ciencias de la Salud Universidad del Valle de México para

tratar

la

Algunos ejemplos de microorganismos causantes de infecciones que pueden encontrarse durante un cultivo del exudado faríngeo incluyen: ● Candida albicans. Este hongo causa aftas, una infección de la boca y la lengua y, a veces, de la garganta. ● Estreptococo del Grupo A. Esta bacteria puede causar faringitis estreptocócica, escarlatina y fiebre reumática. ● Neisseria meningitidis. Esta bacteria puede causar meningitis. (Struthers, 2018) Pasos para la toma de exudado faríngeo. El exudado faríngeo se recomienda para niños y adultos, la forma adecuada para tomarlo y de está manera obtener una buena muestra para la detección de virus respiratorios es la siguiente: a) Se sujeta la lengua del paciente con el abatelenguas y se frota con firmeza la pared posterior de la garganta (orofaringe) con el hisopo de algodón seco y estéril (al frotar obtenemos células infectadas por el virus); se debe tener cuidado de no tocar la epiglotis para no provocar el vómito en el paciente.

Figura 1. Toma de muestra de exudado faríngeo. Pruebas de detección. Catalasa: La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso que se libera en forma de burbujas. El principal objetivo de esta prueba es separar Micrococacceae (positiva) de Streptococcus spp. y Enterococcus spp. (negativa). En esta prueba se reporta un resultado positivo a la observación de burbujas procedentes del oxígeno tras agregar al cultivo dicho reactivo. (UNAM, 2017)

b) El hisopo se introduce en el tubo de ensayo (que contiene solución salina estéril), la parte del hisopo que contiene la muestra se mantiene dentro del tubo, el resto se corta y se desecha, el tubo se cierra perfectamente y se mantiene a 4ºC. c) Cada tubo se marca colocando una tela adhesiva (evitar papel engomado, masking tape o cinta adhesiva), en la cual se escribe el nombre del paciente y la fecha de la toma. d) Los tubos con las muestras deben mantenerse a 4ºC (o en la hielera con refrigerantes si van a ser transportadas. Ver transporte de las muestras), hasta su procesamiento en el laboratorio. (Himfg, I)

Figura 2. Resultado de prueba de catalasa (positiva y negativa) Oxidasa: Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido por el oxígeno molecular produciendo agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de

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electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa solo se encuentra en las bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero las bacterias anaerobias estrictas carecen de actividad oxidasa. Así mismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica. En esta prueba, se reporta como resultado positivo la aparición de un color azul-violeta en la muestra, tras añadir el reactivo al cultivo. Con esta prueba se pueden identificar especies de Neisseria (positiva) y Pseudomonas de los miembros oxidasa (negativo) de las Enterobacterias. (UNAM, 2017)

Escuela de Ciencias de la Salud Universidad del Valle de México la capacidad de fermentación del manitol por los microorganismos. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura. (Rossi, 2012)

Figura 4. Componentes para el agar sal y manitol. Agar nutritivo.

Figura 3. Resultado positivo y negativo para la prueba de oxidasa. Agar sal y manitol. En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano. El manitol es un hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, el rojo fenol es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante. (Rossi, 2012) Se trata de un medio altamente selectivo por la alta concentración salina y diferencial debido a

Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estéril para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales y permite una clara visualización de las reacciones de hemólisis. (Rossi, 2013)

Figura 5. Componentes del agar nutritivo. Agar Eosina Azul de Metileno. Este medio se utiliza para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos

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Gram negativos. Es nutritivo por la presencia de peptona que favorece el desarrollo microbiano. Permite la diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre una amplia variedad de bacterias Gram positivas. El agar es el agente solidificante. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. También, pueden crecer especies de Candida y se observan como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas se observan como colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella. (Rossi, 2015)

Escuela de Ciencias de la Salud Universidad del Valle de México aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. El agregado de 5-10 % sangre ovina desfibrinada estéril promueve el desarrollo de bacterias exigentes en sus requerimientos nutricionales y la adecuada observación de las reacciones de hemólisis. (Rossi, 2018)

Figura 7. Componentes del agar sangre. Para el medio de cultivo de agar sangre, se pueden observar las siguientes reacciones de hemólisis: Hemólisis alfa: Lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un halo de color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) por el peróxido de hidrógeno generado por los microorganismos. Hemólisis beta: Lisis total de los glóbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante alrededor de la colonia en estudio. Hemólisis gamma: Ausencia de lisis de los glóbulos rojos. El medio de cultivo no presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio. (Barraza, 2018)

Figura 6. Componentes del agar Eosina Azul de Metileno. Agar Sangre. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de numerosos microorganismos. Al ser suplementado con sangre ovina, permite el crecimiento de microorganismos nutricionalmente exigentes y la clara visualización de reacciones de hemólisis.

Figura 8. Tipos de hemólisis.

La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de 4

UVM México Tinción (BAAR) Los bacilos resistentes al alcohol ácido o acidorresistentes (BAAR) son un tipo de bacteria que causa tuberculosis (también conocida como TB) y otras infecciones. La tuberculosis es una infección bacteriana grave que afecta principalmente a los pulmones. También puede afectar a otras partes del cuerpo, como el cerebro, la columna vertebral y los riñones. La TB se transmite de una persona a otra al toser o estornudar. Puede ser latente o activa. Cuando está latente, la persona tiene la bacteria de la TB en el cuerpo pero no se siente enferma y no puede contagiar la enfermedad. Cuando está activa, la persona presenta síntomas y puede contagiar.

Escuela de Ciencias de la Salud Universidad del Valle de México aplicación de diferentes medios de cultivo y pruebas. Específicos: ●

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Las pruebas de BAAR se suelen pedir cuando una persona tiene síntomas de TB activa. Detectan la presencia de bacterias BAAR en el esputo. El esputo es la mucosidad espesa que expulsan los pulmones al toser. Es diferente de un escupitajo o de la saliva. (Nuñez, 2020) Tinción Gram. La tinción de Gram es una prueba que detecta bacterias en el lugar donde se sospecha una infección, como la garganta, los pulmones, los genitales o las lesiones en la piel. Las tinciones de Gram también se pueden usar para detectar bacterias en ciertos fluidos corporales, como la sangre o la orina. Hay dos categorías principales de infecciones bacterianas, grampositivas y gram negativas. Las categorías se diagnostican según cómo reacciona la bacteria a la tinción de Gram. La tinción de Gram es de color púrpura. Cuando la tinción se combina con la bacteria en una muestra, las bacterias puede seguir de color púrpura o volverse rosadas o rojas. Si se mantienen púrpuras, son grampositivas. Si se vuelven rosadas o rojas, son gram negativas. (Nuñez, 2020) OBJETIVOS General. Conocer los métodos para la toma de muestra de exudado faríngeo e identificar el crecimiento de microorganismos a través de la

Conocer los tipos de microorganismos que pueden crecer en un exudado faríngeo. Identificar las reacciones que lleva a cabo el agar sangre para que se produzca un halo blanco. Conocer cómo se lleva a cabo la prueba de oxidasa y catalasa y sus características fundamentales para la clasificación de microorganismos. Identificar el procedimiento para la correcta toma de un exudado faríngeo. Conocer el método de tinción Baar y Gram e identificar a través del microscopio.

HIPÓTESIS Se planteó la siguiente hipótesis de acuerdo a los aspectos a estudiar en esta práctica. -

El exudado faríngeo es la prueba estándar para identificar las causas de las infecciones en las vías respiratorias superiores. Al conocer la técnica adecuada para la toma de muestra y los diferentes medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos, podremos caracterizar las colonias obtenidas utilizando diferentes tinciones y de igual manera, podremos identificar algunas características metabólicas como las reacciones de hemólisis y la actividad de enzimas como la catalasa y citocromooxidasa.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Un exudado faríngeo, se realiza para encontrar la causa de un dolor de garganta. La mayoría de las infecciones que provocan dolor de garganta son causadas por diversos microorganismos. Un cultivo de exudado faríngeo muestra la diferencia entre una infección bacteriana y una infección viral. Además, nos ayuda a identificar si una persona presenta o no algún síntoma de infección, en caso de presentar alguna anomalía se detecta si la bacteria que el paciente presenta puede

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transmitirse a otras personas, a está persona se le conoce como portadora. JUSTIFICACIÓN Un exudado faríngeo se hace frotando la garganta con un hisopo para detectar la presencia de bacterias Streptococcus del grupo A y otras bacterias patógenas que causan infecciones como la escarlatina, los abscesos y la pulmonía. Posterior a la toma de muestra, se utilizan medios de cultivo como el Agar sangre donde podemos observar las reacciones de hemólisis que llevan a cabo algunas bacterias del género Streptococcus. El conocer el fundamento y la técnica para realizar un exudado faríngeo es importante ya que gracias a ella, podemos encontrar la causa de un dolor de garganta y si este es provocado por una bacteria estreptocócica, lo que puede ayudar a otorgar un tratamiento adecuado para cada persona. MATERIAL ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

50 cajas de Petri estériles Papel estraza Cinta testigo 5 Pipetas graduadas estériles de 1 ml 1 Matraz de 500 ml con tapa de rosca 1 Espátula 3 abatelenguas 1 Mechero Bunsen 3 pares de hisopos estériles Equipo de tinción BAAR y Gram Asa bacteriológica Peróxido de hidrógeno al 3% Reactivo para prueba de oxidasa.

Escuela de Ciencias de la Salud Universidad del Valle de México ● ● ● ●

200 ml Agar nutritivo 200 ml Agar Eosina Azul de metileno 200 ml de agar sangre 50 ml caldo nutritivo

METODOLOGÍA

Diagrama 1. Procedimiento para llevar a cabo la toma correcta de exudado faríngeo. RESULTADOS Durante esta práctica se repasaron diversos puntos relevantes para antes y después de la elaboración de un exudado faríngeo. Como el conocer como se toma la muestra, como se siembra y los respectivos análisis del cultivo a realizar.

Equipo: ● ● ● ●

Incubadora Balanza Microscopio Autoclave Imagen 1. Medio de cultivo casero.

Sustancias: ●

500 ml solución salina fisiológica (0.85% NaCl) ● Agua destilada ● 200 ml Agar sal y manitol

Se elaboró un medio casero para la toma de muestra (exudado faríngeo) casera.

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Escuela de Ciencias de la Salud Universidad del Valle de México A partir de la muestra casera, así como la de Ziehl Neelsen observada en la Imagen 5.

Imagen 2. Resiembra de muestra. Se tomó una nueva muestra en el laboratorio, y a partir de ahí se re-sembró en nuevos medios de agar sangre y otros medios.

Imagen 5. Elaboración de Tinción de Ziehl Neelsen.

Imagen 3. Siembra de muestra en agares caldo, a partir de exudado. Imagen 6. Colonias de bacterias en agar sangre. A partir de la re-siembra de muestras del exudado principal. se presencia como en el medio si crecieron bacterias, debido a la tapa de la caja petri, no se puede realizar la mejor identificación de morfología, pero en general. Son colonias circulares grandes, con bordes ondulados, textura lisa, sin pigmentación, con elevación plana y translúcidos.

Imagen 4. Elaboración de Tinción de Gram.

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Imagen 7. Colonias bacterianas en agar Sal manitol.

Imagen 8. Observación en microscopio 40X, para resultados de tinción de Gram.

En cuanto a la morfología de las colonias de esta re-siembra de las muestras del exudado, se puede decir que:

Puede observarse en Imagen 8, la presencia de gram positivos y negativos. Con un mayor aumento puede identificarse que se trata de bacilos, así como de ciertas aglomeraciones, en donde no se logra observar bien del todo la clasificación de estos pero se asemeja como “empalizadas”.

Son colonias irregulares, con bordes ondulados, de tamaño grande (3mm aprox o más), de transparencia opaca, sin pigmentación y elevadas.

Imagen 7. Observación en microscopio 40X, para resultados de tinción de Gram. Tras la observación con el microscopio podemos observar de esta muestra de colonia la presencia de cocos gram positivos, en particular asemeja que son “Estreptococos”.

Imagen 9. Observación en microscopio 40X, tras tinción de gram Se observan cocos gram negativos, en particular se trata de “Estafilococos” por la forma de racimo que está presente.

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Imagen 10. Tinción Ziehl-Neelsen de muestras caseras.

Imagen 11. Tinción de Gram de muestra casera.

Imagen 12. Prueba de catalasa. Se realizó la prueba de catalasa para las 3 muestras que se observaron (Imagen 7, 8 y 9), y todas indicaron que son catalasa positiva, por la presencia del oxígeno en forma de efervescencia. Sin embargo, la muestra 1 presenta menor capacidad.

Imagen 13. Infografía de Streptococcus anginosus.

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Escuela de Ciencias de la Salud Universidad del Valle de México pueden falsear los resultados por la actividad de catalasa que presentan eritrocitos.

Imagen 14. Mapa ...