Reporte de practica Extracción de ADN plásmidico por lisis alcalina PDF

Preview

Summary

Reporte de practica de laboratiroio num.2 Extracción de ADN plásmidico por lisis alcalina....

Description

Universidad Autónoma de la Ciudad de México Plantel del Valle

Licenciatura en Ciencias Genómicas

Laboratorio de investigación III Nombre del Prof. Dr. Jonathan Puente Rivera

Titulo

Practica de Laboratorio 2. Extracción de ADN plásmidico por lisis alcalina.

México, DF, 14 de octubre, 2015

Reporte. Objetivo general. Obtener ADN plásmidico de E.coli Objetivos específicos. Conocer la metodología básica para la extracción de ADN plásmidico de bacterias. Determinar la integridad del ADN plásmidico por electroforesis en gel de agarosa. Preparación de disoluciones. 1.

preparación de lisis alcalina I.

Glucosa 50 Mm tris-Cl (pH 8.0) 25 mM EDTA (pH 8.0) 10 mM (guardar a 4°C) 2. Solución de lisis alcalina II. NaOH 0.2 N SDS 1% (w/v) Preparar SDS al 1% en 700 ml partiendo de un stock al 10%

( 1 % ) (700 ml ) =

Formula: c1v1 = c2v2 (10%) (?) =

(1 %)(700 ml ) 10

= 70 ml

70 ml de SDS al 10% Preparar NaOH 0.2 N en 700 ml a partir de 1 N. Formula: c1v1 = c2v2 (1 N) (?) =

( 0.2 N )( 700 ml ) =

140 µl de NaOH 70 ml de SDS 490 ml H2O

(0.3 N )(700 ml ) 1N

= 140 µl

3. Solución de lisis alcalina III 60.0 ml de acetato de potasio 5 M 11.5 ml de Ácido acético glacial 28.5 ml de H2O (guardar a 4°C) 4. Preparar TBE 0.5x en 300 ml a partir de un stock 5x. Formula: c1v1 = c2v2 (5x) (?) =

(0.5 x)(300 ml ) 5x

( 0.5 x )(300 ml ) =

= 30 ml

30 ml de TBE 5x + 270 ml de H2O = 300 ml TBE 0.5x 1. Preparar TBE 1x en 100 ml a partir de un stock 5x. Formula: c1v1 = c2v2 (5x) (?) =

( 1 x ) ( 100 ml)

=

(1 x )(100 ml ) 5x

= 20 ml TBE 5x

20 ml de TBE 5x + 80 ml de H2O = 80 ml TBE 0.5x 2. Preparar un gel de agarosa al 1% en 30 ml con TBE 1x. 100 % = 30 ml

(1 %)(30 ml) = 0.3 g de agarosa 100 %

1% = ? Pesar 0.3 gramos de agarosa y verter 30 ml de TBE 1x Resultados. Las muestras y el buffer de carga (tabla 1 ) se cargaron en el siguiente orden de izquierda a derecha en el gel. Carril. muestra 1. Equipo 1 1 µl marcador pb de 1kb. 2. Equipo 1 2.5 µl. + 1 µl buffer de carga. 3. Equipo 1 9 µl + 1 µl buffer de carga. 4. Equipo 2 2.5 µl + 1 µl buffer de carga. 5. Equipo 2 9 µl + 1 µl buffer de carga. 6. Equipo 3 2.5 µl + 1 µl buffer de carga. 7. Equipo 3 9 µl + 1 µl buffer de carga. Tabla 1. En la tabla se muestra el orden en que se cargó la Muestra en el gel. Resultados. En la (figura 1) se observan los resultados de la visualización del gel de agarosa en la extracción de ADN plásmidico de E. coli

Figura 1. Imagen de un gel de agarosa 1%, visualizado con ayuda de un espectrofotómetro. Utilizando el método de extracción de DNA plásmidico por lisis alcalina, se obtuvo una extracción adecuada ya que se logra observar el contenido de DNA en el gel, por lo cual sería importante tratar la muestra para la realización de posteriores prácticas.

Discusión. El propósito de este trabajo experimental fue la extracción de DNA plasmídico por el método de lisis alcalina; mediante la utilización de este método de extracción se obtuvo DNA plasmídico de gran pureza, gracias a el cambio de polaridad del medio que genera el agregado de alcohol, y la disminución de la temperatura vuelven insoluble al DNA, pudiéndose recuperar en un precipitado centrifugándolo a altas velocidades. Se verifico la presencia del DNA plasmídico por medio de una electroforesis en un gel de agarosa al 1% visualizándolo mediante el uso del espectrofotómetro, obteniendo resultados satisfactorios Este protocolo es comúnmente utilizado para minipreps de DNA plasmídico, En líneas generales, cuanto más chico sea el plásmido, mejor es el resultado obtenido, ya que a medida que se incrementa el tamaño, sus propiedades se asemejan cada vez más a las del DNA cromosómico. Con plásmidos mayores a 25 kb el aislamiento se hace dificultoso y el rendimiento es muy bajo. Sin embargo para los vectores de uso rutinario en este caso el pET22 el rendimiento es muy bueno y el producto obtenido es lo suficientemente puro como para realizar digestiones con endonucleasas de restricción sin necesidad de una purificación y poder utilizarlo para prácticas posteriores o algún trabajo de investigación Conclusión. Los resultados demuestran una buena extracción de DNA plasmídico por medio del método de lisis alcalina, lo que nos dice que hubo una buena preparación de los cultivos, preparación de soluciones, extracción del DNA plasmídico, una buena preparación del gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio, como también una buena manipulación de las micro pipetas al momento de cargar las muestras y el marcador de peso molecular, lo que conlleva a obtener resultados satisfactorios. Cuestionario. El alcohol en la solución de precipitación se utiliza para remover la concentración residual de sales y promover la precipitación del ácido nucleico. Una muestra de ADN en solución acuosa precipita al agregársele cationes (para neutralizar las cargas negativas que posee) y alcohol. El alcohol disminuye la constante dieléctrica del solvente acuoso, provocando una disminución en la solubilidad del ADN, que en presencia de altas concentraciones de sales, precipita. Este método es ampliamente utilizado como una forma de concentrar ADN. El etanol y el isopropanol. La diferencia entre ambos es la capacidad de disminuir la constante dieléctrica. Mientras que el isopropanol posee una mayor capacidad y por lo tanto es posible usar menor volumen (solo 0,7 volúmenes, contra 2,5 volúmenes de etanol), tiene la desventaja de precipitar más sales y por lo tanto rinde un ADN de menor pureza que el etanol. La elección se basa en el volumen manejable, prefiriéndose el etanol siempre que sea posible debido a la mejor calidad del ADN obtenido. Características y representacion del Vector pET22b (+) Nombre: pET22b (+) Descripción: Vector de expresión con el promotor T7 y terminador flanqueando MCS que acepta inserción, tiene secuencia líder pelB de focalización y de etiquetas cds subcelulares (se puede perder con algunas estrategias de inserción); resistencia amp; la clonación de enzima de restricción. Sinónimos: pET22, pET22b, pET22bplus, pET22b + Tipo: plásmido bacteriano

Forma: dsDNA Tamaño (pb): 5493 Propiedades: expresión bacteriana, la transcripción in vitro, la producción ssDNA (DNA de simple cadena), con etiqueta / fusión / marcador tipo

Nombre

Descripción

Posición de comienzo 140

etiqueta

His

MCS

MCS

señal de localización periplásmica promotor gen de la proteína represora origen bacteriano marcador seleccionable origen ssDNA

pelB T7 lacI

Su secuencia de codificación de etiquetas MCS (AvaI, XhoI, NotI, EagI, HindIII, SalI, SacI, EcoRI, BamHI, NcoI) secuencia codificante pelB (secuencia señal para la localización periplasmid) Promotor T7 secuencia codificante de lacI

157

158

225

224

289

361 764

377 1843

E. coli ori ampR

origen pBR322 gen de resistencia a ampicilina

3277 4038

0 4895

ori f1

origen f1 para la producción de ssDNA

5027

5482

Posición final

Tabla 2. Características del vector pET22b.

Figura 2. Imagen del Vector pET-22b(+) y sus regiones de clonación/expresión. El pET-22b (+)) lleva una secuencia Nterminal de señal pelB para el potencial de localización periplásmica, además del C-terminal Su secuencia • Tag® opcional. Los sitios únicos se muestran en el mapa de círculo. La secuencia está numerada por convención del pBR322, por lo que la región de expresión T7 se invierte en el mapa circular.

Figura 3. La región de clonación / expresión de la cadena codificante transcrita por la ARN polimerasa de T7 se muestra a continuación. El origen f1 está orientada de modo que la infección con fago auxiliar producirá viriones que contienen ADN de cadena sencilla que corresponde a la hebra de codificación. Por lo tanto, la secuenciación de una sola cadena se debe realizar utilizando el cebador terminador T7.

Características de cepa DH5-Alpha Clasificación: Dominio: Bacteria Filo: Protobacteria Clase: Gammaproteobacteria orden: Enterobacteriales Familia: Enterobacteriaceae Género: Escherichia Especies: Escherishia coli DH5-alfa Descripción y significado: Esta cepa de E. Coli no es un patógeno, y fue desarrollado para uso clonación laboratorio. Esta cepa fue desarrollada por D. Hanahan como una cepa de clonación con múltiples mutaciones que permiten a las transformaciones alta eficiencia. Las mutaciones que la cepa DH5-alfa tiene son: dlacZ Delta M15 Delta (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-mK +) supE44 thi-1 gyrA96 relA1. Estas mutaciones corresponden a las distintas características que hacen que la cepa DH5alfa se destaque en los procedimientos de clonación.  lacZ Delta M15 mutación: Permite la detección blue-white para las células recombinantes.  

Mutación endA1: Permite la degradación endonucleasa inferior que asegura altas velocidades de transferencia de plásmidos. La mutación recA1: reduce la recombinación homóloga para una inserción más estable.

Estructura del genoma: La estructura genómica de esta cepa es un cromosoma circular singular que consiste en 4,686,137 nucleótidos, genes, 4359 y 4128 genes de la proteína que codifica. Esta cepa también contiene plásmidos, y tiene la capacidad de aceptar la inserción del plásmido excepcionalmente bien. Estructura celular, el metabolismo y el ciclo de vida: E. coli son bacterias Bacillus gram-negativas. Se reproducen por fisión binaria sucesiva con un tiempo de generación de aproximadamente 30 minutos con un crecimiento óptimo se produce a 37 grados centígrados. E. coli son bacterias aerobias y son capaces de la síntesis de ATP a través de la respiración aeróbica y, si el oxígeno no está presente, la fermentación. Esta cepa particular, se

puede identificar y distinguir de otras cepas de E. coli, mediante el examen de la secuencia genética de su subunidad 16S ribosómica pequeña, que ha sido secuenciada completamente. Ecología: Esta cepa de E. coli fue desarrollado en el laboratorio, para los procedimientos de clonación en laboratorio, y por lo tanto no tiene el medio ambiente "natural" o hábitat, ya que no existe en la naturaleza....