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LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR    REPORTE 3. TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS QUIMICAMENTE COMPETENTES (RESTRICCIÓN Y LIGACIÓN)     1 Índice Introducción………………………………………………………………………………….. Objetivos……………………………………………………………………………………….5 Objetivo General…………………………………………………………………………….5...

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LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

REPORTE 3. TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS QUIMICAMENTE COMPETENTES (RESTRICCIÓN Y LIGACIÓN)

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Índice Introducción…………………………………………………………………………………...3 Objetivos……………………………………………………………………………………….5 Objetivo General…………………………………………………………………………….5 Objetivos Específicos….…………………………………………………………………….5 Justificación…………………………………………………………………………..……….5 Metodología…………………………………………………………………………….……...5 Resultados……………………………………………………………………………………..7 Discusión de Resultados……………………………………………………………………..9 Conclusiones………………………………………………………………………………...11 Referencias Bibliográficas………………………………………………………………...12

Índice de Figuras y Cuadros Figura 1. Gel de electroforesis grupal………………………………………...…7 Figura 2. Crecimiento en placas………………....……………………………….8 Figura 3. Características del vector…………..…………………………………10 Figura 4. Sitios de corte en pGEX-2TK………………………………………….10

Cuadro 1. Células Transformadas…………….……………………………….….8 Cuadro 2. Enzimas de restricción utilizadas……………………………………9 Cuadro 3. Eficiencia de transformación………………………………………….9

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INTRODUCCIÓN Una vez aislado el DNAp de una célula bacteriana; se busca modificar su secuencia, mediante enzimas de restricción, las cuales son endonucleasas. Estas tienen la capacidad de escindir los puentes disulfuro de una cadena polinucleotídica. Una región dentro del DNAp, codifica para dichos sitios donde las endonucleasas reconocerán su secuencia específica y cortarán dicha región. Existen diferentes tipos de enzimas de restricción: 

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Tipo I: Cortan las cadenas del DNA en una posición aleatoria, a cierta distancia del sitio de restricción. Hacen cortes no palindrómicos, necesitan ATP y Mg como cofactor. Tipo II: Reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula con absoluta precisión, dentro de la secuencia reconocida. Cortes palindrómicos y necesitan Mg como cofactor. Tipo IIs: Comparten las mismas características que las de Tipo II, sólo que reconocen secuencias no palindrómicas, de 4 a 7 pb. Pueden cortar dentro del sitio de corte y hasta 20pb de distancia. Tipo III: Idénticas a las de Tipo I, sólo que cortan 5 a 8 pb antes o después de la secuencia reconocida.

Dichos sitios de restricción, no son más que secuencias del DNAp, que son reconocidas por dichas endonucleasas y a la vez sitios de hidrólisis, dando lugar a fragmentos de restricción. Existen dos tipos de corte:  

Extremos romos: Fragmentos cuyos extremos no contienen bases desapareadas. Extremos cohesivos: Fragmentos cuyos extremos son desapareados.

Una vez que se han digerido nuestros plásmidos, debemos “unir” el inserto con el vector. Así realizamos una reacción de ligación, a través de DNA ligasas. La más usada es la T4 ligasa, porque une tanto fragmentos romos, como fragmentos cohesivos complementarios. En cambio, la enzima, es sensible a las ligeras variaciones de sales y requieren de ATP. En una reacción de ligación se puede tener DNAp completamente cerrados y no cerrados, y otros productos secundarios que no son deseables en la ligación; pues, reducen el rendimiento de la clonación. Para evitar este tipo de productos, se acude a estrategias experimentales, previas a la mezcla vectorfragmento. Como la desfosforilación el vector con fosfatasa alcalina. Una vez ligadas, se deben preparar las células huésped (aquellas a las que queremos transferir la unidad de información genética e interés). Eso significa, que se harán a las células competentes. Existen diferentes métodos por los cuales una enzima puede ser competente, pero principalmente se tienen células: 3

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Químicamente competentes Físicamente competentes

Células electrocompetentes, es un método que consiste en inducir una diferencia de potencial en las células, para poder incrementar la difusión del DNA hacia el interior de la célula. Células químicamente competentes (Cloruro de Calcio). El principal objetivo de esta técnica es hacer permeable la membrana, mediante interacciones iónicas con la membrana y un choque térmico. Así se facilita la entrada del DNA sobre la superficie celular. La transformación es un método por el cual un ADN ajeno a una célula bacteriana se introduce en esta. La transformación de bacterias tiene una gran relevancia como técnica de almacenamiento y replicación de secuencias de ADN o plásmidos. Por lo general, la mayoría de los plásmidos (incluso los diseñados para células de mamíferos) tienen un origen de replicación bacteriano y un gen de resistencia a antibióticos para usar como un marcador de selección. Este es un procedimiento típico para la transformación y selección de bacterias:

OBJETIVOS Objetivo General 4

Realizar la transformación de células competentes mediante la técnica de choque térmico y haciendo uso de las metodologías de corte por enzimas de restricción y ligación. Objetivos Específicos  Conocer la metodología básica para cortar un vector utilizando enzimas de restricción.  Conocer la metodología básica para ligar un vector previamente cortado con enzimas de restricción.  Conocer la metodología básica para hacer células competentes de Escherichia coli con CaCl2.  Conocer la metodología básica para transformar células competentes con un plásmido bacteriano  Determinar la eficiencia de transformación de células competentes de Escherichia coli preparadas con CaCl2. 

JUSTIFICACIÓN La transformación de organismos es una metodología rutinaria en los laboratorios de Biología Molecular. Un vector se lineariza con enzimas de restricción, mientras que la misma enzima digiere el gen que será insertado. Ambos fragmentos se unen mediante una ligasa en presencia de ATP y esto es insertado en una célula competente. La preparación con cloruro de calcio es muy utilizada por su eficiencia, bajo costo y porque generalmente se obtienen células con altos niveles de transformación. Mientras que como método de transformación se utiliza el choque térmico, también por ser barato y eficiente. METODOLOGÍA

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RESULTADOS

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La transformación se verificó mediante el crecimiento obtenido en medio con antibiótico. También se realizó electroforesis en gel de agarosa para observar la integridad del plásmido utilizado, así como los fragmentos que se obtuvieron mediante la digestión con enzimas de corte.

Figura 1. Fotografía del gel de electroforesis realizado para las siguientes muestras: plásmidos, restricción y ligación (se muestran los resultados de los siete equipos en el grupo). El corrimiento se realizó a 90 v.

Los resultados del crecimiento de las placas inoculadas con células transformadas se registraron en un cuadro grupal (cuadro 1). Cada equipo utilizó una cepa en específico, además de una o dos enzimas de restricción diferentes, como se muestra en el cuadro 2.

Cuadro 1. Número de transformantes obtenidas por medio de choque térmico (cuadro grupal)

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*“+” si hubo crecimiento, “0” no hubo crecimiento , “/” no se evaluó e “INC” número de colonias incontable.

Figura 2. Crecimiento en placas inoculadas con células transformadas (a excepción del control positivo). Se muestra el control positivo (células no transformadas), transformación con el plásmido, células transformadas con plásmido tratado con enzimas de restricción (ER) y transformación con plásmido tratado con ER y posteriormente ligado Cuadro 2. Enzima de restricción utilizada por equipo (cuadro grupal)

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Cuadro 3. Eficiencia de transformación de las células del equipo #6 (datos proporcionados por E6)

DISCUSIÓN La transformación de las células se realizó mediante el vector pGEX-2TK-GSTGFP, el cual, como su nombre lo indica, contiene el gen GST que codifica para la glutatión-s-transferasa y el gen GFP que produce la proteína verde fluorescente (gen reportero), además de resistencia a la ampicilina. Este último gen se denomina marcador de selección, ya que ayudará a diferenciar a la cepa transformada de las células que no lo están, de modo que en un medio con ampicilina sólo sobrevivirán las células que contengan el gen de resistencia al antibiótico, mientras que las otras no crecerán. En la figura 1 se pueden observar los resultados obtenidos tras realizar una electroforesis para las muestras de ADN plasmídico, incluyendo las que fueron tratadas con enzimas de restricción y las que posteriormente se ligaron mediante T4 Ligasa. Mediante las bandas superiores para la muestra de ADNp (P), es posible determinar su tamaño, esto debido a que estas bandas muestran la forma lineal del plásmido. De acuerdo al marcador de pares de bases utilizado (marca Axygen) el tamaño del plásmido está entre los 5000 y 6000 pb, lo que concuerda con la figura 3, que muestra ciertas características del vector proporcionado para la transformación, incluyendo su tamaño (5729 pb). Las bandas no están muy bien definidas, pero esto es debido a que se utilizó más voltaje para acortar la duración de la electroforesis. 9

Es posible observar ciertas diferencias en las bandas de las muestras tratadas con enzimas de corte (fig. 1), esto es debido a que como se muestra en el cuadro 2, cada equipo utilizó diferente enzima o incluso una combinación de 2 de ellas. Las enzimas de restricción Figura 3. Características del vector poseen un sitio de corte en utilizado. específico, es por ello que dependiendo de la enzima que se utilice se generará un corte diferente, por lo tanto, en el gel de electroforesis se podrán observar varias bandas, las cuales muestran los fragmentos obtenidos tras la digestión con las enzimas (Luque, 2002). Las figuras 3 y 4 muestran varios sitios de corte de diferentes ER en el plásmido utilizado (pGEX-2TK). Es importante resaltar que ninguna de las enzimas utilizadas realiza un corte en el gen de resistencia a ampicilina, por lo que se puede inferir que todas las células exitosamente transformadas, aún después del corte enzimático y la posterior ligación, tendrán resistencia al antibiótico. Sin embargo, enzimas como Eco RI y Hind III se acercan bastante al sitio donde está el gen de la GFP, por lo que probablemente si se viera afectada la fluorescencia de las células transformadas (aunque no se realizaron pruebas para confirmarlo).

Figura 4. Sitios de corte en pGEX-2TK

La figura 2 muestra las fotografías de las placas inoculadas con células transformadas. Se puede observar un crecimiento por toda la placa, en los cuatro casos (control positivo, plásmido, ligación y restricción). No hay diferencia notable entre las cuatro, en todas hubo un crecimiento incontable. Es importante tomar en cuenta que la cepa químicamente competente utilizada fue MACH 1 y una de sus características, según el inserto de su fabricante, es que tiene un rápido crecimiento (en 8 horas ya será posible observar colonias). 10

Probablemente se debió hacer el conteo en placa mucho antes de lo realizado, para tener crecimiento que si fuera cuantificable. Otra posible solución a esta problemática es haber hecho diluciones, lo cual habría evitado el crecimiento desmedido que se obtuvo en casi todos los equipos del grupo (a excepción del equipo 6). En el cuadro 1 se muestran los resultados grupales del conteo en placa de las células transformadas. Las variaciones dependen de la cepa y las enzimas de restricción utilizadas, además del manejo que hizo cada equipo de sus reactivos y material. Es probable que la cepa DH5α muriera en el traslado al laboratorio, por lo que no se logró registrar crecimiento en las placas de ambos equipos que la utilizaron. TOP 10 y MACH 1 tuvieron bastante crecimiento, pero sólo el equipo 6 obtuvo resultados contabilizables. El equipo anterior proporcionó un cuadro con los resultados de eficiencia de transformación de sus células (cuadro 3), lo cual es el cociente del número de UFC y los microgramos de ADNp utilizados. Según el inserto de MACH 1, la cepa utilizada por el equipo 6, la eficiencia de transformación debería ser mayor a 1 x 109 UFC/µg, pero los resultados arrojan una eficiencia mucho menor. La eficiencia de transformación puede ser afectada por varios factores, por ejemplo el periodo de crecimiento en el cual se induce la competencia. Es importante que las bacterias se encuentren en la primera fase del crecimiento logarítmico. Se menciona este factor en específico porque, como se mencionaba anteriormente, MACH 1 es una cepa que crece bastante rápido, por lo que cuando se realizó la transformación la cepa ya no se encontraba en la fase deseada. Probablemente la poca eficiencia se deba al tiempo que se dejó crecer MACH 1 (Tang, 2005). CONCLUSIONES   

Se logró la transformación de las células competentes de E. coli comprobado en su crecimiento en placas petri con ampicilina. En la mayoría del grupo no se logró determinar eficiencia de transformación. Las enzimas de corte utilizadas no interfieren con la función del gen de resistencia a ampicilina.

REFERENCIAS

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Checa, A. (2018). Método: Células competentes y transformación. 2018, Octubre 10, Conogasi.org Sitio web: http://conogasi.org/articulos/metodo-celulas-competentes-ytransformacion/ Lodish, H. (2008). Molecular Cell Biology. España: Editorial Panamericana. Luque, J. (2002). Texto Ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Primera edición. España: Elsevier Science. Reece, J.B. (2011). DNA tolos and biotechnology. En Campbell biology. CA: Pearson. 10°Ed. Págs. 408-435. Rivera, A., Gómez, M., Fernández, F. & Loske, A. (2014). Tranformación genética de las células utilizando métodos físicos. J Genet Syndr Gene Ther. 5:237. Tang, R. (2005). The return of copy‐choice in DNA recombination. Wiley Online Library. https://doi.org/10.1002/bies.950161102 Thermofisher (2018). Células competentes para la transformación. Recuperado el 24/09/2018 de: www.thermofisher.com

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