Secuenciación por ligadura PDF

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Secuenciación por ligadura (SOLiD) SOLiD es un método enzimático de secuenciación que utiliza ADN ligasa, una enzima utilizada ampliamente en biotecnología por su capacidad para unir cadenas de ADN bicatenario. La PCR en emulsión se usa para inmovilizar / amplificar una región de unión a cebador de ADNss (conocida como adaptador) que se ha conjugado con la secuencia diana (es decir, la secuencia que se va a secuenciar) en una cuenta. Estas perlas se depositan sobre una superficie de vidrio; se puede lograr una alta densidad de perlas que, a su vez, aumenta el rendimiento de la técnica. Una vez que se ha producido la deposición de perlas, se hibrida un cebador de longitud N con el adaptador, luego las perlas se exponen a una biblioteca de sondas de 8 meros que tienen diferentes colorantes fluorescentes en el extremo 5 'y un grupo hidroxilo en el extremo 3'. Las bases 1 y 2 son complementarias a los nucleótidos a secuenciar, mientras que las bases 3-5 están degeneradas y las bases 6-8 son bases de inosina. Solo una sonda complementaria se hibridará con la secuencia diana, adyacente al cebador. La ADN ligasa se usa para unir la sonda de 8 meros al cebador. Un enlace de fosforotioato entre las bases 5 y 6 permite que el tinte fluorescente se separe del fragmento usando iones de plata. Esta escisión permite medir la fluorescencia (se utilizan cuatro colorantes fluorescentes diferentes, todos los cuales tienen diferentes espectros de emisión) y también genera un grupo 5'-fosfato que puede someterse a una nueva ligadura. Una vez que se completa la primera ronda de secuenciación, el producto de extensión se derrite y luego se realiza una segunda ronda de secuenciación con un cebador de longitud N − 1. Muchas rondas de secuenciación usando cebadores más cortos cada vez (es decir, N − 2, N − 3, etc.) y midiendo la fluorescencia aseguran que el objetivo esté secuenciado. Las bibliotecas cementadas fragmentadas o emparejadas se enriquecen por medio de PCR en emulsión en microperlas, que luego se adhieren a un portaobjetos de vidrio. Se agrega un conjunto de cuatro sondas 1,2 (cada una etiquetada con un fluoróforo diferente) compuesto por ocho bases a la celda de flujo, compitiendo por la ligadura al cebador de secuenciación. Las dos primeras posiciones de la sonda abarcan un par de bases conocido específico para el fluoróforo; Estas dos bases consultan cada primera y segunda base en cada reacción de ligadura. Las bases 3 a 5 son bases degeneradas separadas de las bases 6 a 8 por un enlace fosforotiolato. Una sonda 1,2 coincidente está unida al cebador por ADN ligasa. Después de la imagen de fluorescencia para evaluar qué sondas 1,2 conectadas, los iones de plata rompen el enlace de fosforotiolato, regenerando así el grupo fosfato 5 'para la ligadura posterior. Este procedimiento (hibridación del cebador, ligadura selectiva de las sondas, imágenes de cuatro colores y escisión de la sonda) se repite continuamente, el número de ciclos determina la duración de la lectura final. Después de alcanzar una longitud satisfactoria, el producto extendido se separa, el

procedimiento comienza de nuevo y la plantilla se reinicia con un cebador complementario a la posición n - 1 de la ronda anterior de cebadores. La plantilla se alarga mediante ligaduras sucesivas y luego se restablece cuatro veces más (se completan cinco rondas de restablecimiento del cebador para cada etiqueta de secuencia). Este procedimiento de reinicio del cebador da como resultado que cada base sea consultada en dos reacciones de ligadura independientes por dos cebadores diferentes, un sistema de verificación y equilibrio que se determina mediante la creación y alineación de una serie de imágenes de cuatro colores. El acrónimo SOLiD significa secuenciación mediante ligadura y detección de oligonucleótidos. A diferencia de las plataformas 454 y Solexa que utilizan un enfoque de secuenciación por síntesis, la plataforma SOLiD utiliza un enfoque de secuenciación por ligadura y emplea la química de secuenciación por ligadura para secuenciación. En resumen, la técnica comprende los siguientes pasos: (1) preparación de la biblioteca de secuenciación de ADN (fragmentación de ADN 1 ligadura del adaptador), (2) formación de un complejo de microesferas de fragmentona, (3) amplificación de fragmentos por em-PCR, (4) purificación, (5) inmovilización de microesferas en portaobjetos de vidrio y (6) secuenciación por ligadura. La preparación de la biblioteca de secuenciación para la secuenciación SOLiD implica el cizallamiento de moléculas de ADN grandes en fragmentos de 400600 pb. Los fragmentos se reparan por el extremo, se ligan al adaptador y se inmovilizan en perlas paramagnéticas. El proceso de dilución y anclaje asegura que solo una plantilla por ubicación esté atada. Los fragmentos en las cuentas se amplifican por em-PCR, las cuentas con plantillas extendidas se separan de las cuentas no deseadas, las plantillas extendidas en las cuentas se modifican en 30 extremos y luego las cuentas se inmovilizan en un portaobjetos de vidrio. La química de secuenciación por ligadura utiliza un sistema de consulta de dos bases (dos bases) para interrogar la secuencia y un tinte fluorescente para la detección. Esto también se conoce como codificación de dos bases. El sistema utiliza cuatro tintes fluorescentes para interrogar a las dieciséis (42) combinaciones posibles de dos bases. Este sistema utiliza una serie de sondas; cada sonda tiene ocho nucleótidos (nt) de largo (8-mer), en el que las dos primeras bases en el extremo 50 representan la combinación única de dos bases, y el fluoróforo está en el extremo 30. El proceso comienza cuando un cebador de secuenciación puede hibridarse con el adaptador universal. Luego, una sonda que contiene la combinación de dos bases complementaria a las dos bases inmediatamente 30 al adaptador se hibrida. El emparejamiento de bases da como resultado la unión del 8-mer al cebador de secuenciación, extendiendo así el cebador de secuenciación. El paso de la ligadura es seguido por la detección de fluorescencia y la llamada a la base. A continuación, una etapa de regeneración elimina tres bases 30 del 8-mero ligado (incluido el grupo fluorescente). Esto prepara el cebador extendido para otra ronda de ligadura. Este proceso se repite hasta que se alcanza una longitud de

lectura específica. Luego, esta secuencia hibridada extendida se derrite y el proceso se repite con nuevos 8 mers (reinicio del cebador)...