Seminario Biofilm Microbiologia PDF

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BIOFILM O BIOPELICULAS ORIGEN Las biopelículas fueron observadas inicialmente por Anton van Leeuwenhoek en 1684, cuando analizó muestras de placa microbiana obtenidas de sus propios dientes. Años después, en 1864, Louis Pasteur también las observó en muestras obtenidas de las paredes de barriles donde se almacenaba vino; además, propuso que eran las causantes de que el vino se biotransformara en ácido acético. A finales de los años 1980, la definición de «biopelículas» únicamente se había utilizado en microbiología ambiental, porque su formación se había observado en los tubos que transportan agua potable y en la parte inferior de los barcos, principalmente. En microbiología médica, el concepto de biopelículas era completamente ajeno; sin embargo, en 1985, el Dr. John William Costerton (el padre de la biofilmología) trajo este concepto al área médica y propuso que muchas de las infecciones crónicas podrían ser causadas por microorganismos que estuvieran creciendo en forma de biopelículas, y que, por esta característica, los pacientes no respondían a los tratamientos antimicrobianos convencionales. Las investigaciones sobre biopelículas han aumentado de manera exponencial en los últimos 20 años. Las primeras estuvieron encaminadas a descubrir y entender los mecanismos genéticos y moleculares que favorecen que los microorganismos crezcan en forma de biopelículas, a conocer la composición química de la matriz extracelular y a estudiar los cambios fisiológicos, morfológicos y bioquímicos que sufren las células microbianas en las biopelículas. Los estudios más recientes están enfocados a estudiar en modelos in vitro e in vivo la patogénesis de las biopelículas DEFINICION Las definiciones de biofilms existentes en la literatura son múltiples pero todas ellas describen de manera similar la interrelación que se establece entre los diferentes microorganismos que componen la comunidad y la estructura sobre la cual están soportados. A continuación se citan algunas de las definiciones más relevantes: • Comunidades microbianas adheridas a una superficie, rodeadas por una matriz extracelular polimérica de origen microbiano y otros compuestos del medio3. • Una comunidad estructurada de células bacterianas embebidas en una matriz polimérica propia y adheridas a una superficie viva o inerte4. • Un consorcio funcional de microorganismos organizados en una extensa matriz polimérica5. • Una comunidad de microorganismos embebidos en una matriz poliméricaorgánica, adheridos a una superficie6. • Una comunidad compleja de microorganismos, unidos irreversiblemente a una superficie, a una interfase o entre ellos, embebidos en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares, que exhiben una alteración del fenotipo con respecto a su rata de crecimiento y trascripción genética. COMPOSICION Y ARQUITECTURA Toda comunidad microbiana desarrollada en biofilm es única en su género, aunque algunos atributos estructurales pueden, generalmente, ser considerados universales. El término biofilm es, en cierto modo, un nombre inapropiado, puesto que los biofilms no constituyen un depósito superficial de una monocapa continua1. Los biofilms están estructurados principalmente por grandes colonias de bacterias sésiles incrustadas en una matriz polimérica extracelular o glicocálix. Las células bacterianas, que componen el 15%-20% del volumen, no se dividen al interior de los biofilms, lo cual podría atribuirse al hecho de adoptar un fenotipo alterado, diferente al de las mismas bacterias en estado de libre flotación8. La matriz es muy hidratada debido a que incorpora grandes cantidades de agua dentro de su estructura, llegando este elemento a representar hasta el 97% de ésta1. Además de agua y gérmenes, la matriz está

formada por exopolisacáridos (EPS), los que constituyen su componente fundamental, producidos por los propios microorganismos integrantes. En menor cantidad se encuentran otras macromoléculas como proteínas, ácidos nucleicos, y diversos productos que proceden de la lisis bacteriana. El conjunto de polisacáridos, ácidos nucleicos y proteínas se conocen bajo el nombre de substancias poliméricas extracelulares (SPE). En la matriz también puede hallarse materiales no bacterianos, tales como cristales de sales minerales, partículas de corrosión y/o de sedimento, o componentes sanguíneos, según sea el medioambiente en el cual se desarrolla el biofilm. Además, los EPS pueden estar asociados con iones metálicos y cationes bivalentes. Pueden tener carga neutra o carga polianiónica, según el tipo de exopolisacárido, lo que les permitiría interactuar con distintos antimicrobianos, de forma tal que estos pueden quedar atrapados en la matriz sin capacidad para actuar sobre las bacterias10 La producción de EPS es influida por la calidad nutricional del medioambiente. Se ha observado que un incremento en la concentración de nutrientes está correlacionado con un aumento en el número de células bacterianas adheridas. Además, una disponibilidad excesiva de carbono y/o limitación de nitrógeno, potasio o fosfato promueve la síntesis de EPS La arquitectura de la matriz no es sólida. Las bacterias biofilm viven en torreones celulares que se extienden en forma tridimensional desde la superficie a la cual están adheridas. Estos torreones están compuestos por microcolonias de diferentes células bacterianas, tanto aeróbicas como anaeróbicas, englobadas por exopolisacáridos, y separadas unas de otras por espacios intersticiales huecos, llamados canales de agua, que permiten el flujo de líquido y actúan como un sistema circulatorio primitivo para el transporte y difusión de nutrientes y oxígeno a las bacterias ubicadas en su interior, incluso aquéllas situadas en las zonas más profundas del biofilm. Asimismo, constituyen un mecanismo para la remoción de productos de desecho metabólico1 La existencia de estos canales de agua no impide, sin embargo, que dentro del biofilm se encuentren ambientes en los que la concentración de nutrientes, pH u oxígeno es diferente. Se genera, de esta manera, una gradiente de tensión de pH y de oxígeno, siendo metabólicamente más activas las áreas superficiales respecto a las más profundas. En estas últimas, las bacterias deben adaptarse a una disponibilidad reducida de oxígeno La formación y estructura de un biofilm depende de las características del substrato al cual se une y a otros aspectos del medio ambiente. Así, los biofilms en una superficie mucosa son fisiológicamente diferentes de aquellos formados en superficies inertes. Se ha acuñado el término “biofilm de mucosa” para describir aquellos que son característicos en mucosas. Estos, aunque estrechamente relacionados con los encontrados en superficies inertes, no son idénticos en cuanto a su expresión génica ni en la naturaleza de sus microambientes. Los biofilms de mucosas son modulados por la respuesta inflamatoria del huésped y, además, por proteínas y células del huésped que contribuyen a su composición10 ESTRUCTURA DEL BIOFILM Por medio de métodos de observación directa como el microcopio láser cofocal de barrido (CSLM), el cual permite observar el biofilm bacteriano in vivo , en tiempo real y completamente hidratado, además de brindar la posibilidad de tener imágenes en 3D, se ha mostrado claramente que la gran mayoría de los biofilms están compuestos por microcolonias de células bacterianas (15 - 20% volumen), envueltas en una densa matriz polimérica extracelular (75 - 80%) con marcados canales de agua8 Los biofilms no sólo están formados por bacterias, sino también por otros tipos de microorganismos como hongos, levaduras, algas y protozoos. Un biofilm, puede estar formado por una o varias especies distintas. Generalmente, las colonias de microorganismos se forman en medios acuáticos (interfase sólido-líquido), pero también pueden encontrarse en interfases aire-líquido y sólido-aire. Las microcolonias existen en diferentes formas dentro de los biofilms los cuales son modelados por fuerzas segadoras debido al paso de fluidos sobre los mismos. Con una fuerza modeladora baja, las colonias son morfológicamente como torres o en forma de hongo, con grupos celulares circulares separados por vacíos;

mientras que con altas fuerzas de modelado, las colonias son elongadas en la dirección del flujo y capaces de realizar oscilación rápida, teniendo así la ventaja del afluente, lo que puede incrementar el transporte de solutos a través del biofilm. Las microcolonias individuales pueden consistir de especies únicas pero más frecuentemente están compuestas por muchas especies diferentes9 Igualmente, condiciones ambientales como una escasa nutrición pueden afectar la estructura del biofilm, presentándose una estructura más abierta, con más espacios vacíos y mayor cantidad de canales de agua. La matriz es un complejo de origen bacteriano así como de sustancias exógenas que se encuentran en el medio ambiente, y que incluyen ácidos nucleicos, proteínas, nutrientes, etc. Está formada en un 95% por agua; además es predominantemente aniónica, de manera que crea un sistema para atrapar los minerales y nutrientes del medio externo que rodea al biofilm. La matriz mantiene unidas las microcolonias que se van formando y les brinda protección frente a amenazas externas Dentro del biofilm, las microcolonias están separadas por una red de canales de agua que funcionan como un sistema circulatorio primitivo, actuando como un medio de transporte de nutrientes y de remoción de productos de deshecho. Los nutrientes hacen contacto con las microcolonias sésiles adheridas por difusión desde los canales de agua hasta ellas. ETAPAS EN EL PROCESO DE FORMACION DEL BIOFILM La etapa inicial del proceso de formación del biofilm es la adherencia sobre la superficie (Fig. 2). En bacterias Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella enterica) se ha visto que los flagelos, las fimbrias de tipo I, IV y los curli son importantes para la etapa de adherencia primaria6. La motilidad parece que ayuda a la bacteria a alcanzar la superficie y contrarrestar las repulsiones hidrofóbicas. Sin embargo, aunque la motilidad ayuda al proceso no parece ser un requisito esencial, pues muchas bacterias Gram positivas inmóviles como estafilococos, estreptococos y micobacterias son capaces de formar biofilm. En el caso de las bacterias Gram positivas se ha descrito la participación de proteínas de superficie (AtlE, Bap, Esp) en esta primera etapa de adherencia primaria7,8. Una vez que la bacteria se ha adherido a la superficie, comienza a dividirse y las células hijas se extienden alrededor del sitio de unión, formando una microcolonia similar a como ocurre durante el proceso de formación de colonias en placas de agar. En una etapa posterior la bacteria comienza a secretar un exopolisacárido que constituye la matriz del biofilm y forma unas estructuras similares a setas (mushrooms) entre las cuales se observa la presencia de canales. La composición del exopolisacárido es diferente en cada bacteria y varía desde alginato en P. aeruginosa, celulosa en S. typhimurium, un exopolisacárido rico en glucosa y galactosa en V. cholerae, polyN-acetilglucosamina en S. aureus, etc. Además, estudios recientes han puesto de manifiesto que incluso una misma bacteria, dependiendo de las condiciones ambientales en las que se encuentre, puede producir distintos exopolisacáridos como componentes de la matriz del biofilm. Así, algunas cepas de P. aeruginosa son capaces de producir además de alginato un polisacárido rico en glucosa que forma una película en la interfase medio aire al que se ha denominado “Pellican”. Finalmente, algunas bacterias de la matriz del biofilm se liberan del mismo para poder colonizar nuevas superficies cerrando el proceso de desarrollo de formación del biofilm. La liberación de las bacterias desde el biofilm es el proceso que menos se conoce. En el caso de Staphylococcus aureus se ha descrito un proceso de variación de fase producido por la inserción reversible de un elemento de inserción (IS256) en el interior del operón (icaADBC) responsable de la síntesis del exopolisacárido del biofilm. El proceso de inserción del elemento parece ocurrir aleatoriamente en la población con una frecuencia de 10-6 y produce bacterias deficientes en la síntesis del exopolisacárido y por tanto deficientes en la formación del biofilm. Esto permite a la bacteria mantener un pequeño porcentaje de la población incapaz de sintetizar el exopolisacárido y poder escapar del biofilm. Como la inserción es un proceso reversible, el salto del IS desde el operón ica provocará una nueva variación de fase9. Otra alternativa descrita en S. aureus consiste en la obtención de variantes deficientes en la formación del biofilm debido a la eliminación de una isla de

patogenicidad que contiene elementos esenciales para el proceso de formación del biofilm10. En Actinobacillus actinomicetecomitans se ha descrito una actividad enzimática, denominada dispersina que degradan de forma específica el exopolisacárido de la matriz del biofilm. La presencia en distintos genomas de hipotéticas proteínas (endoglucanasas), que podrían ser responsables de una función similar, sugiere que la degradación controlada del exopolisacárido puede representar un mecanismo controlado de liberación de bacterias del biofilm. FASES DE FORMACION DEL BIOFILM 1. Adsorción de moléculas del huésped y bacterias a la superficie En la mayoría de los casos, las superficies expuestas absorben moléculas que forman una película condicionante a la cual se adhieren las bacterias8. Adicionalmente, los productos del metabolismo bacteriano y las enzimas bacterianas específicas presentes en la saliva, también son incorporados a la película, y de esta forma promueven la adherencia de especies bacterianas específicas. Esta película condicionante (película adquirida) se forma inmediatamente después de que el material entra en contacto con el ambiente. Esta formación genera una alteración de la energía superficial y de la carga de las superficies18, estas películas proveen receptores específicos para la adherencia bacteriana. La formación de la película adquirida permite la adhesión bacteriana, pues provee sitios de anclaje para los microorganismos, permitiendo que éstos se adhieran y colonicen superficies. El rol de esta película condicionante es vital, pues muchos microorganismos no tienen mecanismos de adhesión que les permitan colonizar ciertas superficies. Como se dijo anteriormente, la película adquirida no sólo facilita la adherencia bacteriana, sino que también funciona como fuente de nutrientes a las bacterias que se adhieren a ella. 2. Adhesión bacteriana primaria La adhesión primaria consiste en el encuentro entre una superficie y una bacteria planctónica. Esta fase es reversible y está basada en una serie de variables fisicoquímicas que definen la interacción entre de la pared bacteriana y la superficie en cuestión. En principio, la bacteria tiene que acercarse a la superficie, bien a través de una corriente de flujo, o de forma más directa, por quimiotaxis o por movilidad de la propia bacteria4. Una vez que ésta está extremadamente cerca de la superficie (a menos de 1 nm), lo que determina que se produzca la unión, es la suma de unas fuerzas atractivas o repulsivas en ambas superficies. Entre ellas se encuentran las interacciones electrostáticas que tienden a favorecer la repulsión ya que la mayoría de las bacterias y las superficies inertes están cargadas negativamente 3. Adhesión bacteriana secundaria La unión entre ambas superficies se consolida por la producción de exopolisacáridos por parte de la bacteria, que se acoplan con los materiales de la superficie, por ligandos específicos de receptores localizados en los pilis, fimbrias y fibrillas de la bacteria, o la unión de ambos procesos a la vez. Esta unión es irreversible y la bacteria queda firmemente unida a la superficie inerte. Durante esta fase, las bacterias planctónicas se pueden unir también unas a otras (Co-agregación), y a diferentes especies que estén ya unidas al material (Co-adhesión), formando las llamadas microcolonias de sustrato 4. Maduración del biofilm Una vez que la bacteria se ha unido a la superficie de forma irreversible, comienza el proceso de maduración de biofilm. La densidad y la complejidad del biofilm aumenta cuando las bacterias que lo forman comienzan a dividirse activamente (o a morir) y los compuestos extracelulares originados por las bacterias unidas interaccionan con las moléculas orgánicas e inorgánicas del medio y crean el glicocálix. El crecimiento de cualquier biofilm está limitado por la disponibilidad de nutrientes, la difusión de nutrientes hasta las células y la eliminación de los productos de desechos. Además existe un flujo hidrodinámico que atraviesa el biofilm que favorece el crecimiento y la difusión más que la erosión que las

capas más externas. Otros factores que controlan la maduración del biofilm son el pH, la difusión del oxígeno, la fuente de carbono y la osmolaridad. 5. Desprendimiento activo El equilibrio dinámico de un biofilm se alcanza cuando las capas más externas de éste comienzan a generar células planctónicas metabolitamente activas y capaces de dividirse, las cuales pueden colonizar nuevas superficies20. Esta liberación de bacterias se puede dar por dos mecanismos: (1) Erosión (pérdida de células individuales) y (2) Migración (pérdida de agregados mayores). ETAPAS EN EL CICLO VITAL La biología de los biofilms se centra en su ciclo vital e interacciones con el medio ambiente. El ciclo vital es un proceso dinámico que puede ser dividido en 3 partes: adhesión, crecimiento y separación o desprendimiento. Durante la primera fase, el substrato tiene que ser adecuado para la adsorción reversible y, finalmente, la adhesión irreversible de la bacteria a la superficie. Las bacterias, una vez percibida una superficie, proceden a formar una unión activa vía apéndices, como fimbrias, flagelos o pili. Mediante microscopía electrónica se ha descrito que las bacterias adheridas se encuentran conectadas a la superficie por medio de finas fibrillas poliméricas extracelulares. Las fimbrias, probablemente luego de superar la barrera de repulsión electroestática inicial que existe entre el germen y el sustrato, contribuyen a la adhesión bacteriana La motilidad, otorgada por flagelos, ayudaría a la bacteria a alcanzar la superficie en las etapas iniciales de la adhesión, siendo su función principal vencer las fuerzas de repulsión más que actuar como adherente. Sin embargo, la motilidad no pareciera ser un requisito esencial, puesto que bacterias Gram positivas inmóviles, como estafilococos, estreptococos y micobacterias, también poseen la capacidad de formar biofilm. En el caso de las bacterias Gram positivas se ha descrito, en esta primera etapa, la participación de proteínas de superficie La adhesión de bacterias a una superficie ocurrirá más fácilmente en aquéllas más ásperas, más hidrofóbicas, y recubiertas por “films condicionantes”. Se ha descrito que la colonización microbiana parece incrementar a medida que aumenta la aspereza de la superficie. Esto sería debido a que están reducidas las fuerzas de deslizamiento, y el área de superficie se torna mayor2. Los films condicionantes, compuestos habitualmente por polímeros, cubren inevitable y rápidamente la superficie de cualquier material que se encuentre en contacto con un líquido, y constituyen requisito indispensable para una ulterior adhesión microbiana. Un buen ejemplo en el hombre puede ser el film conocido como “película adquirida”, que se desarrolla en superficies del esmalte dental. Este film consta de albúminas, lisozimas, glicoproteínas, fosfoproteínas, y lípidos. Las bacterias de la cavidad oral colonizan, al cabo de algunas horas, aquellas superficies condicionadas por esta película Las propiedades físico-químicas de la superficie también pueden ejercer una fuerte influencia en el grado y extensión de la adhesión. Se ha encontrado que los gérmenes se adhieren más rápidamente a superficies hidrofóbicas, no polarizadas, como lo es el teflón y otros plásticos, en comparación con materiales hidrofílicos, como vidrio o metales. Aparentemente se produciría algún tipo de interacción hidrofóbica entre la superficie celular y la del sustrato que permitirían a la bacteria superar las activas fuerzas de rechazo a cierta distancia de...