TEMA 1 - Biotecnología vegetal clásica PDF

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Juan Camacho...

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Biotecnología vegetal - Tema 1

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL TEMA 1: BIOTECNOLOGÍA VEGETAL CLÁSICA 1. 2. 3. 4.

Biotecnología tradicional y clásica frente a biotecnología moderna Mejora vegetal clásica Técnicas de la mejora vegetal clásica Estado actual y perspectivas de la mejora vegetal clásica

¿Qué es biotecnología? Concepto de biotecnología Conjunto de técnicas que utilizan organismos vivos o partes de ellos para obtener productos o modificarlos, para mejorar plantas o animales, o para desarrollar microorganismos con fines bien determinados (obtención de bienes y servicios). Según el Convenio sobre la Biodiversidad Biológica (CDB) 1992, la biotecnología es toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos y sus derivados, para la creación o modificación de productos o procesos, para usos específicos. La biotecnología tradicional es básicamente aquella que se realizaba antes de utilizar la mutagénesis y la transgénesis. Incluye procesos que llevan mucho tiempo realizándose aunque no se conociera su base teórica, como la fermentación alcohólica o láctica. La biotecnología moderna empieza a desarrollarse con la tecnología del ADN recombinante (rRNA) y transgénesis.

1. BIOTECNOLOGÍA VEGETAL CLÁSICA VS BIOTECNOLOGÍA VEGETAL MODERNA CLÁSICA Se conoce desde los albores de la humanidad. Se inicia con el desarrollo de la agricultura (domesticación) Trabaja con genomas completos Generación de variabilidad genética a través del cruzamiento y selección posterior

MODERNA Se inicia con la aplicación de técnicas del DNA recombinante

Se trabaja con genes aislados Aumenta la variabilidad mediante la adición o alteración de genes seleccionados a priori (se reduce la selección posterior) Sigue siendo óptima para el manejo o Ofrece mejoras para caracteres que dependen transferencia de caracteres que dependen de de uno o varios genes (Ej: resistencia a 1

Biotecnología vegetal - Tema 1 muchos genes (Ej: Rendimiento, potencial) enfermedades, plagas…) La BTVC (Biotecnología Vegetal Clásica) lleva utilizándose, aunque sin conocimiento, desde que se comenzó a utilizar la agricultura, ya que esta es una domesticación de las plantas. Esto implica una selección de caracteres que de forma natural no se habrían seleccionado, ya que estarían destinados a perderse por suponer desventajas para el desarrollo y la reproducción de la planta, pero que facilitan, por ejemplo, su recolección. Un ejemplo de esto es una mutación en la que, al madurar la vaina de una planta leguminosa esta no se abriera, lo que impediría que las semillas se propagaran eficientemente, pero facilita la recolección de las mismas. Esto implica que ya el hecho de cultivar las plantas es de algún modo “antinatural”. Por otro lado, la BTVM (Moderna) se desarrolla en un laboratorio, modificando el genoma de la planta. La BTVC trabaja con genomas completos, ya que se basa en el cruzamiento de individuos. Por tanto, habrá descendientes que tengan el carácter que queremos y otros que no, y dependiendo de este carácter, será más o menos difícil seleccionar las que lo posean. Esto no es 100% cierto, ya que hoy en día existen técnicas para saltarnos el cruzamiento. En cambio, la BTVM trabaja directamente con los genes de interés (no necesariamente de la misma especie) estos se introducen en nuestra variedad de planta comercial. Una limitación de la BTVM es que hay un tamaño máximo de genoma que se puede introducir en una planta, por lo que no es conveniente para caracteres que vengan definidos por más de 10 genes, mientras que estos caracteres pueden seguir tratándose con BTVC, ya que trabaja con genomas completos. Por otro lado, la selección de las plantas con el carácter que nos interesa es más sencilla con las técnicas modernas. La BTVC, en cambio, presenta la limitación de la compatibilidad sexual, es decir, no puedes introducir un carácter de una especie a otra si estas no pueden cruzarse. En la moderna esto sí que es posible, incluso puedes introducir genes bacterianos. BIOTECNOLOGIA VEGETAL CLÁSICA Y MODERNA SON COMPLEMENTARIAS Y NO EXCLUYENTES La BTV clásica es muy utilizada y continuará utilizándose junto a la moderna, ya que es óptima para los caracteres que dependen de muchos genes. La BTVC no es cuestionada medi Percepción pública de la biotecnología moderna Las principales inquietudes que genera la BTVM son: • La aprehensión instintiva hacia las nuevas tecnologías: • La desconfianza en las agencias reguladoras: En cierto modo, esta aversión a los cultivos transgénicos se debe a razones económicas y empresariales, ya que están bajo el dominio de unas pocas empresas solamente.

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Biotecnología vegetal - Tema 1 • La dominancia de las corporaciones multinacionales: Debido a que el desarrollo económico de los cultivos transgénicos está bajo su responsabilidad. • La amenaza a la biodiversidad: Se dice que la BTVM reduce la biodiversidad, cuando la agricultura en general implica baja biodiversidad, porque consiste en sembrar exclusivamente la variedad más rentable. De todas formas, existen bancos de germoplasma, es decir, de semillas de todas las variedades cultivables por si se necesitan por el ataque de un hongo, plaga, etc. • La competencia con los sistemas de producción agrícolas alternativos Ambos tipos de biotecnología conllevan una modificación del genoma, pero sólo se cuestiona la moderna por desconocimiento, ya que en ambos estamos modificando el genoma de la planta, estamos escogiendo qué genes queremos de cara a una producción más rentable. ¿Hasta qué punto es la BTVC más natural que la BTVM? Como se ha hablado antes, la domesticación induce la selección de caracteres que de forma natural no se seleccionarían. Por ejemplo, en los cereales salvajes las espigas son quiescentes, se quiebran cuando están maduras para dispersar mejor las semillas. Durante la evolución, una mutación espontánea produjo variedades con espiga tenaz, que no se parte, lo que no tiene sentido a nivel natural ya que no se esparcirían las semillas, lo que implica, que la mutación estaba destinada a desaparecer. Sin embargo, el hombre la seleccionó de forma artificial ya que facilita la recolecta de las semillas. La ingeniería genética, solo representa un nuevo método para realizar los cambios que se realizaban mediante domesticación y cruzamiento.

Biotecnología vegetal - Tema 1 De igual modo, se seleccionó artificialmente variedades de leguminosas cuya vaina no se abre al madurar, patatas que carecen de solanina, un alcaloide muy tóxico, etc. La mutagénesis, que forma parte de la BTVC, consistente en producir mutaciones al azar y buscar alguna conveniente, es más peligrosa que la ingeniería genética (que se realiza por transformación generalmente) porque produce más cambios no deseados. Es cierto que con toda manipulación te arriesgas a que ocurran cambios inconvenientes, pero hoy en día hay técnicas para detectarlos y solucionarlos. Con BTVM podemos hacer en el laboratorio lo que la naturaleza tarda en hacer años de forma espontánea.

2. MEJORA VEGETAL CLÁSICA La mejora vegetal clásica es el conjunto de técnicas que hacen posible la modificación genética de distintas poblaciones de plantas para obtener variedades que tengan las características deseadas. Consiste en la introducción consciente de diversidad genética en las poblaciones (generalmente por cruzamiento de los progenitores con características sobresalientes y complementarias) y en la selección de las plantas con los genes que confieren los caracteres agronómicos deseados, hasta alcanzar niveles altos de adaptación, uniformidad genética y estabilidad agronómica.

Premisas para un programa de mejora

Se hace modificación genética buscando cambios heredables. Como se basa en el cruzamiento, debe existir más de una variedad para poder cruzarlas, de otro modo habría que generarla por mutagénesis. Objetivos de un programa de mejora

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Biotecnología vegetal - Tema 1 Entendemos por capacidad tecnológica la facilidad de cultivar, recolectar el vegetal, etc. Es decir, facilitar la recolección, el cultivo. La mejora vegetal clásica trata de imitar los procesos evolutivos naturales dirigiéndolos a un fin concret FINALIDAD Seleccionar la mejor variedad Generar variabilidad Hibridar Aumentar la dotación cromosómica Enriquecer genéticamente la población

MECANISMO EVOLUTIVO Selección natural Mutación Hibridación espontánea Poliploidía natural

MÉTODO DE MEJORA Selección artificial Mutagénesis artificial Cruzamiento artificial Inducción de poliploides

Mantenimiento de la heterocigósis (no endogamia)

Utilización de heterosis o vigor híbrido: obtención de híbridos comerciales

La hibridación siempre se da entre especies iguales o muy cercanas, ya que interfiere la incompatibilidad sexual. Se puede aumentar la dotación cromosómica mediante fallos en el huso mitótico utilizando colchicina, lo que en plantas suele suponer un aumento del tamaño de los tejidos. Vigor híbrido: Para enriquecer genéticamente la población, utilizamos líneas puras (aquellas que son homocigótica para todas sus características) pero de distintas poblaciones. Normalmente se obtienen híbridos que son mejores que sus parentales en características agronómicas.

3. TÉCNICAS DE MEJORA VEGETAL CLÁSICA Las técnicas básicas de la MVC son: 1. 2. 3. 4. 5.

Selección artificial Cruzamiento artificial Mutación inducida Alteraciones cromosómicas Cultivo in vitro

1. Selección Cualquier fuerza capaz de modificar el número de descendientes y su contribución génica a la generación descendiente  

SELECCIÓN NATURAL: proceso de mejora genética que la naturaleza realiza a lo largo del tiempo SELECCIÓN ARTIFICIAL: Guiada por el hombre, quien decide qué variedad pasa sus características a la descendencia - Selección masal: Se seleccionan las semillas de las plantas que parecen más grandes, vigorosas, sanas, etc. Una limitación es que sólo se puede usar cuando los caracteres repercuten en el fenotipo (no se detecta por ejemplo la producción de enzimas..) Como 5

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consecuencia de la fertilización cruzada (las flores de la planta robusta son fertilizadas por abejas con polen de otras plantas con características peores), la descendencia lleva una carga genética no tan buena como la parental. Se desplaza la distribución en campana de Gauss de la media típica de una característica a una media más elevada (semillas, peso, granos mas grandes) Selección asistida por marcadores

(La foto muestra que de la misma planta, Brassica oleracea, se han obtenido por selección artificial productos como el brócoli, la coliflor o el repollo). 2. Cruzamiento artificial Apareamiento controlado entre dos organismos concretos. También se llama hibridación. Se coge polen de una planta y se lleva al pistilo de otra. Sólo puede hacerse entre individuos de la misma especie o entre especies muy cercanas, es decir, especies sexualmente compatibles. En el cruzamiento tradicional, los miles de genes pertenecientes a una planta se combinan con los miles de genes de su compañera de cruzamiento. Este proceso seguramente transfiere aquella característica deseada, pero también puede transferir rasgos no deseados. Por ejemplo, la planta híbrida puede llegar a tener un sabor desagradable que antes no estaba presente. Esto requiere que los agricultores tengan que realizar muchos cruzamientos más para eliminar la característica no deseada, y esto puede llevar muchos años. Con el cruzamiento tradicional la incorporación del rasgo deseado se produce al azar, y lleva muchos años seleccionar los ejemplares buscados. Por el contrario, con la biotecnología moderna aplicada a la mejora vegetal, tenemos una herramienta más precisa que nos permite incorporar sólo el rasgo deseado, en mucho menor tiempo. Retrocruzamiento Se seleccionan los híbridos de la primera generación filial F1 que tengan la característica de interés y los cruzamos con el parental receptor (o recurrente) sucesivamente, disminuyendo la carga génica del donador, seleccionando tras cada cruce la característica que nos interesa. De este modo buscamos un descendiente que tenga todo el genoma del parental receptor excepto el gen de interés, aportado por el donador, reduciendo la carga génica del segundo recibida a exclusivamente el gen de interés. 6

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3. Mutación inducida Es importante en los programas de mejora. Es fuente de variabilidad genética al igual que las mutaciones espontáneas, pero son producidas por agentes mutagénicos.

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Las radiaciones muy energéticas producen roturas cromosómicas y otras mutaciones muy accidentadas. El método más usado es el uso de agentes químicos.

INCONVENIENTES -

Pérdida de control: no sabes dónde se va a producir la mutación Muchas son recesivas y no pueden detectarse en la F1 La mayoría son indeseables. Selección difícil

VENTAJAS -

Pueden ser generadas en todas las especies, no sólo en las que se reproducen sexualmente (tampoco se pueden transformar todas con bacterias)

Obtencion de supermachos: Hacemos individuos haploides a partir de machos, algunos tendrán solo Y. Estos intentan hacerse diploides YY para obtener plantas supermacho que tienen mejores características.

El agente mutagénico más utilizado en plantas es el etil metano sulfonato (EMS), que produce la alquilación (etilación o metilación) de la guanina que ya no se aparea con la citosina 7

Biotecnología vegetal - Tema 1 provocando la transición GC  AT en el siguiente ciclo (la G se une a T en vez de a C, y en el siguiente ciclo esa T se aparea con A, de modo que se cambia la pareja). Esta mutación de cambio de pareja de bases puede provocar la aparición de codones STOP y cambio de aminoácidos (alelo) que afecten a la estructura y actividad de proteínas. Para que se complete la mutación deben ocurrir divisiones celulares (replicación). El EMS se usa generalmente en solución, que se pone en contacto con las semillas de las plantas. En el interior de la semilla está el embrión cuyas células se estarán dividiendo. El EMS afecta la replicación del genoma de las células que se están dividiendo, introduciéndose mutaciones en algunas de las células. Obtendremos en la mayoría de los casos plantas quimeras, con algunas células mutadas que tienen la mutación en heterocigósis (en uno de los alelos de un gen) Estas plantas no son buenas para realizar estudios. Las plantas sometidas a EMS pueden desarrollarse como plantas quimeras, que tienen células mutadas y otras no mutadas. Esto puede ocurrir si la mutación ocurre en un tejido meristemático del embrión. Si la mutación ha ocurrido en una célula del meristemo apical del tallo, las células de los tejidos adultos que deriven de esta serán mutantes. Las plantas quimeras son difíciles de estudiar, por lo que se utiliza para el estudio la siguiente generación (M2), fruto de la autofertilización de la M1 (se fertilizan ovulos de la planta con su propio polen en caso de que tanto la flor como el polen procedan de células mutadas (así el gameot tendra los dos alelos del gen mutantes)), evitando cruces. La autofertilización ocurre fácilmente en algunas plantas como Arabidopsis, o si no, se ayuda a que ocurra. Así obtenemos organismos homocigóticos en la M2, lo cual nos permite ver mutaciones recesivas que antes no eran visibles. Después se procede al estudio de la función de los genes mutados, usando la M2 se buscan fenotipos interesantes de forma experimental. Por ejemplo se pueden sembrar en un medio con un metal pesado como el mercurio para intentar obtener plantas resistentes a él. La mayoría de plantas morirá, pero si sobrevive será porque ha sido mutado un gen que favorece la supervivencia en un medio con Hg. Una vez encontramos la función tenemos que caracterizar el gen, usando generalmente marcadores moleculares. (Lo veremos en el tema 3).

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También se puede estudiar la función de los genes mutados usando la técnica TILLING, que consiste en buscar mutantes a priori en genes interesantes y conocidos para nosotros. Por ejemplo, si estamos estudiando un gen A, conociendo su secuencia y hacemos un experimento de mutagénesis. Aislamos el genómico de diferentes plantas y hacemos una PCR con los primers y estudiamos qué individuos han sufrido mutación. Ampliación sobre el TILLING (ya que lo vamos a ver en AD) TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) permite la directa identificación de mutaciones en un gen específico. Es una técnica de “genética reversa”, es decir, se identifica variación en una secuencia concreta y se trata de asociar a la misma una función biológica o fenotipo. Este método combina la técnica de mutagénesis con EMS con una técnica que identifica mutaciones en una sola base (puntuales) en un gen diana. Se basa en la formación de heteroduplex de ADN cuando múltiples alelos son amplificados por PCR y son calentados y después enfriados lentamente. Se forma una burbuja entre las dos cadenas de ADN en las bases que no encajan (mismatch), que es cortada por una mezcla de nucleasas de cadena sencilla (como mung bean, aunque esta presenta actividad no específica y sólo funciona a altos pH). Después los productos son separados por tamaño en distintas plataformas como electroforesis o cormatografías. La función del gen se esclarece después relacionando la mutación identificada con el fenotipo mostrado por el individuo en cuestión.

(La ampliación está hecha con Wikipedia y algo más, para AD supongo que habrá que buscar más cosas en artículos y tal, pero al menos así tenéis una idea).

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Biotecnología vegetal - Tema 1 4. Alteraciones cromosómicas

Obtención de monoploides 4.1. Una forma de obtener monoploides es el cultivo de polen o alteras (estructuras de la flor, que es hermafrodita). Se realiza in vitro se obtienen individuos haploides porque el grano de polen y el óvulo son n. Consiste en aislar las anteras y cultivar el polen in vitro en unas condiciones concretas, obteniendo una planta completa monoploide (se verá en la asignatura Cultivos celulares de 4º). Es útil para estudiar mutaciones recesivas, sin esperar a que crezca la F2, ya que sólo hay un alelo, y para obtener líneas celulares puras, duplicando su carga genética y convirtiéndolo en homocigótico para todos los caracteres. Son interesantes para obtener híbridos heterocgóticos, que superan a sus predecesores en características. Puede hacerse también con óvulos pero es menos rentable, cualitativa (son más difícil de aislar y cultivar) y cuantitativamente (hay mucho más polen que óvulos en las flores). Usos de monoploides -

Mutagénesis Selección del fenotipo deseado Duplicación artificial (líneas diploides puras del fenotipo deseado)

4.2. Obtención de poliploides utilizando colchicina La poliploidía es la multiplicación de la carga genética (número de cromosomas). La colchicina es una droga que inhibe la polimerización de los microtúbulos, y por tanto, la formación del huso mitótico, de modo que las células no segregan correctamente sus cromosomas duplicados, 10

Biotecnología vegetal - Tema 1 obteniendo células con la carga genética duplicada. La colchicina se aplica directamente a las células de las yemas apicales que darán lugares a ramas con células poliploides y partir de estas, fruta. La regeneración de la planta será 4n. Esto nos interesa porque normalmente la duplicación de la carga genética implica un aumento del tamaño, es especial de los frutos. (alopoliploidía y autopoliploidia?)

5. Cultivos in vitro Lo veremos en el Tema 2

4. ESTADO ACTUAL VEGETAL CLÁSICA

Y

PERSPECTIVAS

DE

LA

MEJORA

La mejora vegetal clásica ha propiciado la aparición de variedades muy interesantes de arroz, maíz, trigo, hortalizas, etc, y se sigue y seguirá usando. Algunos logros alcanzados hasta hoy en día mediante MVC son: -

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