Tema 3: Replicación del DNA PDF

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3. Replicación del DNA 3.1. Características principales de la replicación del ADN 

La replicación es semiconservativa

Una cadena sirve de molde para la síntesis de una nueva cadena. Al final de la duplicación, cada molécula de DNA presenta una hebra original (o vieja) y una hebra nueva. Demostrado por Meselson y Stahl en 1958. 

Comienza en secuencias concretas denominadas orígenes de replicación y es bidireccional

Los orígenes de replicación (OriC) son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla de replicación. Por otro lado, la replicación se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Se ha visto que en procariotas existe un único origen de replicación, mientras que en eucariotas hay varios. En los puntos o secuencias de origen de replicación, el ADN parental es desenrollado y las cadenas separadas son replicadas. 

Semidiscontinua

El procedimiento comienza con la formación de una burbuja de replicación y dos horquillas de replicación. Es semidiscontinua, pues una de las hebras, la hebra conductora, crece en sentido de la horquilla (se sintetiza de forma continuada), mientras la otra, la hebra retardada, se va sintetizando en fragmentos pequeños (fragmentos de Okazaki) en dirección opuesta, los cuales se disponen de manera separada. Es decir, es continua en una de las cadenas y discontinua en la otra. La dirección de síntesis se da en sentido 5’  3’. Esto plantea un problema ya que si ambas cadenas se sintetizan a la vez en sentidos distintos, mientras una lo hace en sentido 5´  3´, la otra tendría que hacerlo en dirección 3´  5´, cosa que es imposible de realizar. El problema se soluciona mediante los fragmentos de Okazaki, que tienen una longitud de entre uso pocos centenares o miles de nucleótidos. Requieren de un cebador de RNA. En eucariotas, los fragmentos de Okazaki, son sintetizados por las ADNpol. δ, mientras que en procariotas lo son por las ADNpol. III. Se sintetizan en sentido 5´  3´ (pues las ADNpol. solo trabajan en este sentido) y una vez eliminado el cebador, las DNA ligasas unen los diferentes fragmentos entre sí. Así, el avance de la horquilla se produce en el sentido de replicación de la hebra continua.

3.2. ADN polimerasas La reacción de síntesis del DNA la llevan a cabo las DNA polimerasas. Consiste en la transferencia de un grupo fosforilo. El nucleófilo es el grupo hidroxilo del nucleótido en el extremo 3’ de la cadena en crecimiento. Hay diversos tipos de ADN polimerasa, sin embargo, todas ellas necesitan: 

Un cebador (primer). Es un segmento de cadena (complementario del molde) con un grupo 3’ hidroxilo libre al cual puedan añadirse nucleótidos. Las DNA polimerasas solo pueden añadir nucleótidos a una cadena preexistente. La reacción que se lleva a cabo es:

No pueden iniciar la síntesis del ADN a partir de dNTP (desoxirribonucleótidos trifosfato) libres. Catalizan la unión de nucleótidos al extremo 3´OH.

La



Una cadena o hebra de ADN que sirva como molde: una de las dos hebras del ADN (ssADN).



dNTPs para ir formando la estructura de polinucleótidos de la nueva cadena.



Cationes divalentes: Mg2+, Mn2+, Zn2+



En la primera, una hebra de RNA o DNA apareada al molde de DNA es simultáneamente degradada por ésta, y reemplazada por la actividad polimerasa del mismo enzima. Esta actividad es importante tanto para la reparación como en la eliminación del cebador en un proceso denominado traslación de la mella.



En el segundo caso, se eliminan nucleótidos mal apareados para que la DNA polimerasa pueda volver a empezar la polimerización.

Actividad polimerasa 5´  3´: La DNApol I, cataliza la adición, paso a paso, de las unidades desoxirribonucleolíticas a la cadena de ADN:

(DNA)n + dNTP  (DNA)n+1 + PPi

Actividad exonucleasa 3´  5´: Separa los nucleótidos mal apareados del extremo 3´ de las cadenas en crecimiento, incrementando así la fidelidad de la replicación. Los apareamientos incorrectos son reconocidos por el sistema de edición por su forma y tamaño. La edición implica el CAMBIO DE LA POLIMERASA a actividad 5´ 3´. Actividad exonucleasa 5´ 3´: hidroliza ADN a partir del extremo 5´de la cadena (separa ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos del extremo 5´). Actúa en la reparación del ADN y la eliminación del RNA cebador en la replicación

Fragmento de Klenow Un fragmento grande de la DNA polimerasa I, denominado fragmento de Klenow, tiene actividad de polimerización y corrección de errores. Este fragmento se puede utilizar para la replicación in vitro de DNA (técnica de PCR). Actualmente se utiliza la Taq polimerasa (de la bacteria Thermus aquaticus).

ADN polimerasas de E.Coli. (y procariotas en general) En la bacteria E.Coli, se han identificado hasta 3 tipos de DNA-polimerasas. La DNA pol III es el enzima principal de la replicación de esta bacteria. Comete un error cada 106-108 bases añadidas (teniendo en cuenta la acción del sistema de corrección de pruebas). En la copia de DNA se sabe que hay un error cada 109-1010 nucleótidos. Ello se debe a procesos de reparación del DNA. Las principales diferencias son: 





DNA pol I  monómeros  función principal: Elimina el cebador y rellena los huecos de la hebra retardada. 

polimerización 5´ 3´



exonucleasa 3´ 5´



exonucleasa 5´ 3´

DNA pol II  monómeros  función principal: Reparación del ADN. 

polimerización 5´ 3´



exonucleasa 3´ 5´



NO exonucleasa 5´ 3´ Ǿ

DNA pol III  complejo  función principal: Enzima principal en la síntesis de ADN. 

polimerización 5´ 3´;



exonucleasa 3´ 5´;



NO exonucleasa 5´ 3´ Ǿ

3.3. DNA polimerasa III La DNA polimerasa III está formada por 17 subunidades (y 10 genes). Existen subunidades α, ε y θ que forman polimerasas núcleo, τ, γ, δ y δ’ que forman el complejo de carga de la abrazadera y χ, ψ y β que forman la abrazadera de DNA. Dos subunidades núcleo se unen mediante subunidades al complejo de carga de la abrazadera. La abrazadera aumenta la procesividad de la DNA pol III.

3.4. El repliosoma El conjunto de proteínas necesarias para la replicación, incluida la DNA pol III, se denomina replisoma. Está formado por: 

Proteína SSB, la cual se une a la cadena sencilla de DNA.



Helicasa (DNAB) que separa la doble cadena de DNA (con gasto energético).



Primasa (DNAG), que sintetiza el primer (cebador) de RNA.



DNA pol III, que se encarga de la elongación de la cadena de nueva síntesis.



DNA pol I, la cual elimina primers y rellena los huecos.



DNA ligasa, que se limita a ligar fragmentos utilizando ATP o NAD+.



DNA topoisomerasa II (DNA girasa), que evita el estrés topológico durante el desenrollamiento del DNA.

3.5. Etapas de la replicación del DNA La replicación del ADN es un proceso que se produce en 3 pasos: 

INICIACIÓN  Reconocimiento de los orígenes de replicación. Establecimiento horquillas de replicación.  Separación de hebras.  Posicionamiento de la maquinaria transcripcional y síntesis del cebador y adición de los primeros nucleótidos de cada nueva cadena.



ELONGACIÓN  Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.  Replicación semiconservativa, semidiscontinua y coordinada.



TERMINACIÓN  Reconocimiento de señales de terminación.  Desensamble de los replisomas.

3.6. Origen e iniciación de la replicación del DNA 1. Reconocimiento de los orígenes de replicación El origen de replicación (oriC) consta de 245 bp. La proteína DNAA se une en varios sitios de OriC provocando la desnaturalización de la región DUE (región rica en pares A-T). A continuación se une la DNAB (helicasa) con ayuda de la DNAC. La DNAB desenrolla todavía más el DNA para que tenga lugar el cebado y posterior síntesis de DNA.

2. Separación de hebras 

La DNAB o helicasa es la enzima que cataliza el desenrrollamiento y la separación de la doble hebra de DNA rompiendo los puentes de hidrógeno.



La acción de las helicasas genera un estrés topológico que es eliminado por la DNA girasa (DNA topoisomerasa II).



Se generan regiones monohebra que pueden presentar complementariedad de bases y formar regiones estructuradas en hélices. Esta estructuración es evita da por las proteínas SSB (se unen a las hebras simples de DNA y ayudan a mantener las hebras separadas).

3. Posicionamiento de la maquinaria transcripcional y síntesis del cebador y adición de los primeros nucleótidos de cada nueva cadena.

3.7. Elongación Antes de iniciarse la síntesis de las nuevas cadenas, se debe sintetizar un pequeño fragmento de RNA cebador (sintetizado por la enzima ADN primasa en procariotas y por la ADNpol α en eucariotas), al cual la ADN polimerasa adiciona nuevos nucleótidos.

Una vez que ya se ha sintetizado el RNA cebador, la DNA polimerasa III (ADNpol δ en eucariotas), cataliza la síntesis de las nuevas hebras en dirección 5´ 3´, mediante la adición de nucleótidos al extremo 3´OH del nucleótido anterior. Una vez iniciada, la síntesis de la hebra conductora transcurre de manera continua, al mismo ritmo que el desenrollamiento del DNA en la horquilla de replicación.

Mientras, como ya se ha comentado, la hebra retardada se sintetiza de manera discontinua mediante los fragmentos de Okazaki. La síntesis de los fragmentos de Okazaki, se produce en dirección 5´ 3´. Requiere de un cebador de RNA, sintetizado por la ADNprimasa. En procariotas la síntesis de este cebador se realiza mediante la ADNpol III; en eucariotas por la ADN α.

Finalmente, una vez formados estos, la actividad exonucleasa 5´ 3´ de la ADNpol I, va eliminando los ribonucleótidos del cebador, a medida que los sustituye por desoxirribonucleótidos hasta el extremo 3´.

Finalmente, la discontinuidad generada, al eliminar el cebador, se cierra por acción de la ADN ligasa: forma enlaces covalentes fosfodiéster entre el extremo 3´ del nucleótido anterior (ya de otro fragmento) y el extremo 5´ del primer nucleótido del siguiente fragmento. Requiere de NAD+ o ATP como cofactor para proporcionar la energía necesaria para la síntesis del enlace fosfodiéster. Participa así, en los procesos de replicación y reparación del DNA.

La síntesis de ambas hebras la realiza la DNA pol III, que se desplaza en la dirección indicada. Ello implica que la cadena retardada debe hacer un bucle para orientarse correctamente en esa dirección.

La coordinación de movimientos en la síntesis de DNA por la DNA pol III

La coordinación de la síntesis de las dos hebras es compleja. Ambas son producidas por un único dímero asimétrico de DNA pol III. Para ello, la hebra rezagada forma un lazo que aproxima los dos puntos de polimerización. Para ello, la helicasa DNAB y la primasa DNAG forman un complejo denominado primosoma.

La DNA pol II utiliza un juego de sus subunidades núcleo para cada una de las hebras, que en el caso de la rezagada se sitúa entre un fragmento de Okazaki y el siguiente, sobre el bucle formado por la hebra rezagada. La helicasa desenrolla el DNA en la horquilla de replicación, a medida que viaja a lo largo del molde de la hebra rezagada en dirección 5’-3’. La primasa se asocia con la helicasa y sintetiza un primer ante el que se posiciona una abrazadera de la DNA pol III.

Cuando se completa la síntesis de un fragmento, la replicación se detiene y las subunidades de la DNA pol III se disocian de su abrazadera y se asocian a la siguiente. Esto inicia la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki.

En procariotas, la actividad 5’  3’ exonucleasa de la DNA pol I elimina uno a uno los ribonucleótidos del cebador al mismo tiempor que añade los desoxiribonucleótidos en el extremo 3’. La discontinuidad generada al eliminar el cebador se “cierra” por acción de la DNA ligasa.

3.8. Terminación Las horquillas de replicación se encuentran en una región terminal llamada Ter que contiene alrededor de 20 bp. Éstas evitan la sobrereplicación. Cuando lo hacen, los pares de bases de DNA finales se replican mediante un mecanismo todavía desconocido. El resultado final son dos cromosomas circulares ligados en el espacio (encadenados). En E.coli, se requiere la acción de la topoisomerasa IV. Los cromosomas separados son segregados entre las células hijas en la división celular.

En resumen, se obtienen dos cromosomas encadenados y se requiere la acción de la topoisomerasa IV para separarlos.

3.9. Replicación del DNA en eucariotas En eucariotas, el mecanismo y la maquinaria de replicación es similar, pero más complejo. Las principales que se dan en función de la fase o etapa de la que estemos hablando son: 

La iniciación presenta diferentes orígenes de replicación, no solamente uno como en el caso de los procariotas.



En la elongación o síntesis de DNA, existe un mayor número de DNA polimerasas (hay 5, no 3):



o

DNA pol α. Primasa, sintetiza el cebador para la cadena retardadada: 10 bases de DNA y 25 de RNA.

o

DNA pol δ. Replicación DNA (similar a DNA pol III en procariotas).

o

DNA pol ε. Replicación y reparación del DNA (similar a DNA pol I en procariotas).

o

DNA pol β. Reparación DNA.

o

DNA pol γ. Replicación de DNA mitocondrial.

En la terminación, existe un mecanismo específico para la replicación de los extremos de los cromosomas (de los telómeros).

Evidentemente, existe una mayor complejidad para llevar a cabo el proceso por la existencia de DNA asociado a histonas (recordemos que el DNA bacteriano es circular, mientras que el DNA de eucariotas está altamente compactado). Además, el ciclo celular está regulado por ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas, lo que complica todavía más el mecanismo.

3.10. Telómeros y telomerasa Los extremos de un cromosoma lineal no pueden ser replicados por las DNA polimerasas celulares. La replicación del DNA requiere un molde y un cebador, pero más allá del extremo de una molécula de DNA lineal no hay molde disponible. Sin un mecanismo especial para replicar los extremos, los cromosomas se acortarían algo en cada generación celular. El problema lo soluciona la telomerasa, un enzima que incorpora telómeros a los extremos de los cromosomas.

Telómeros: 

Estructura que confiere estabilidad al cromosoma.



Suelen ser secuencias repetidas en tándem: Una de las hebras posee un extremo protuberante en 3’ (en humanos existen alrededor de 1000 repeticiones en tándem de la secuencia TTAGGG). Es la telomerasa la que une estos extremos repetitivos a los extremos del cromosoma.



Este mecanismo es desarrollado para evitar el acortamiento de las cromátidas hijas en cada ciclo celular.

Telomerasa: 

Transcriptasa inversa modificada. Complejo de ribonucleoproteína (RNA+proteína) que sintetiza un fragmento de DNA a partir de un RNA molde propio de 150 nucleótidos.



Este RNA incluye una secuencia de 15-22 bases rica en C, lo que proporciona el molde para la síntesis de secuencias ricas en G del telómero. Así, actúa como transcriptasa inversa sintetizando DNA a partir del RNA molde.



La síntesis del telómero requiere el extremo 3’OH de un cromosoma como cebador y progresa en dirección 5’ 3’. El RNA de la telomerasa, que contiene algunas repeticiones cortas, se aparea con el extremo 3’OH del DNA y sirve de molde para la síntesis del DNA complementario. Una vez añadidos algunos nucleótidos el enzima se transloca (actuando así como molde movible) para comenzar de nuevo y sintetizar así las secuencias repetidas del telómero. Este mecanismo permite el alargamiento del extremo protuberante 3’OH del DNA.



Después de la extensión, la hebra complementaria será sintetizada por las DNA polimerasas celulares a partir de un cebador de RNA.

Formación de un lazo T en eucariotas 

En eucariotas superiores, con telómeros con muchos miles de pares de bases, el extremo de cadena sencilla está secuestrado en una estructura especializada llamada lazo T.



El extremo 3’ del cromosoma invade el DNA dúplex (en la región telomérica) donde se unen proteínas TRF1 y TRF2, implicadas en la formación del lazo.



Los lazos T protegen estos extremos 3’ haciéndolos inaccesibles a las nucleasas y a los enzimas que reparan roturas de la doble cadena.



En las células germinales, que contienen actividad telomerasa, se mantiene la longitud de los telómeros, no siendo así en células somáticas, que carecen de telomerasa. Existe una relación inversa entre la longitud de los telómeros y la edad del individuo.



Las células cancerosas expresan niveles elevados de telomerasa, cosa que no hacen las células normales.

3.11. Reparación del DNA en eucariotas Los mecanismos de reparación del DNA en eucariotas son numerosos, y en ellos participan diversos enzimas, incluidas varias DNA polimerasas. Se utiliza la información de la hebra de DNA no modificada.

Podemos distinguir tres pasos en los mecanismos de reparación: 1. Reconocimiento de la base o bases que no encajan. 2. Eliminación de esta base o bases. 3. Reparación del hueco generado utilizando una DNA pol y una DNA ligasa. Las escisiones de doble hebra de DNA se reparan por recombinación.

En el genoma humano hay más de 130 genes que codifican para proteínas implicadas en la reparación del DNA. Defectos en varios de estos genes están asociados con el cáncer.

Existen diversas modalidades de reparación del DNA eucariótico, entre las que destacan: 

Reparación de apareamientos incorrectos. El sistema debe ser capaz de discriminar entre la hebra molde y la de nueva síntesis. La célula logra este objetivo marcando el DNA molde con grupos metilo. Consta de, al menos, 12 componentes proteicos que funcionan en la discriminación de las hebras o bien en el propio proceso de reparación.



Reparación por escisión de base. Las DNA glucosidasas reconocen lesiones frecuentes de DNA y eliminan la base afectada rompiendo el enlace N-glucosídico. El corte crea sitios apurínicos o apirimidínicos, conocidos como sitios AP o abásicos. Una vez formado, otro tipo de enzima ha de repararlo. No se realiza simplemente insertando una nueva base y formando el enlace, sino que la desoxiribosa 5’fosfato restante es eliminada y reemplazada por un nuevo nucleótido. Los AP endonucleasas cortan la cadena de DNA que contiene el sitio AP. Se elimina el fragmento que contiene el sitio AP y la DNA pol ε se encarga de sustituir los nucleótidos, actuando la DNA ligasa.



Reparación por escisión de un nucleótido. Un enzima multimérico (excinucleasa) hidroli enlaces fosfodiéster, uno a cada lado de la distorsión. Los oligonucleótidos limitados por las - za dos incisiones son liberados, y el hueco es rellenado por la DNA pol ε, bajo la acción de DNA ligasa.



Reparación propensa al error (TLS). En una horquilla de replicación bloqueada, la falta de información requerida debe proceder de un cromosom...