Tema 4 Marcaje de una sonda (Southern, Northern, etc) PDF

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Profesor: Manolo ...

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Marcaje de una sonda (Southern, Northern, etc) 1. Cebadores aleatorios. Requieres el ADN de la muestra problema desnaturalizado, óligos pequeños que hibridarán al azar, polimerasa y nucleótidos radiactivos y no radiactivos (se combinan porque un exceso de nucleótidos radiactivos hacen más frágil la sonda). 2. PCR con cebadores y/o nucleótidos radiactivos 3. Marcaje de extremos 5’ mediante el uso de la fosfatasa alcalina que quita el 5’P y la quinasa que lo sustituye por un fosfato radiactivo (P32) proveniente del ATP. 4. Marcaje de extremos 3’. Cortas con EcoR1 y echas polimerasa ( klenow) que rellene los huecos con nucleótidos radiactivos. También puede usarse la actividad exonucleasa de la polimerasa I combinada con la polimerización con nucleótidos radiactivos. 5. Primero pones una exonucleasa (ADNasa I) que haga huecos (nick translation). A continuación pones una ADN polimerasa con actividad exonucleasa y nucleótidos radiactivos y no radiactivos. La actividad exonucleasa hará que la polimerasa se coma un poco de la secuencia a partir del corte del enzima de restricción mientras que la actividad polimerasa rellenará esos huecos con nucleótidos marcados. 6. Marcaje de ADN. Usamos una ADN polimerasa independiente de molde y nucleótidos marcados, los cuales serán añadidos al extremo 3’ de las moléculas de ADN. 7. Marcaje de ARN por transcripción in Vitro. Generamos ARN in Vitro mediante el uso de nucleótidos radiactivos y polimerasas de ARN específicas de promotores (las más comunes son las del fago T3, T7 y SP6). 8. Métodos no radiactivos. Marcaje de los nucleótidos con digoxigenina de manera que son reconocidos por anticuerpos.

Tema 4. Vectores de Clonación. Estrategias de clonación e identificación de recombinantes. Los vectores son moléculas empleadas para transportar ADN, deben ser capaces de replicar el ADN (amplificación). Como mínimo tienen un origen de replicación, un gen marcador fácilmente seleccionable (resistencia a antibióticos, producción de antibióticos, degradación de compuestos aromáticos, resistencia a metales pesados) y un sitio de clonación múltiple (polylinker). El MCS consiste en un fragmento corto de ADN con muchos sitios de restricción diferentes, cada uno de ellos único para el vector; además puede formar parte del marco abierto de lectura de un gen responsable de alguna característica fenotípica, por lo que resulta sencillo confirmar si tras la clonación se ha insertado efectivamente un fragmento de ADN, ya que la inclusión de este, interrumpe la secuencia del vector, lo cual provoca la pérdida de funcionalidad del gen mediante inactivación por inserción. En plásmidos, el MCS lo metemos artificialmente. Tipos de vectores de clonación

1. Plásmidos Son moléculas de ADN circular de doble cadena, extracromosómicas, presentes en las baterias y algunos eucariotas como las levaduras, que poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación, ya que, son pequeños (cuanto más pequeño es un vector mayor es el fragmento que podemos clonar en él), circulares, tienen replicación independiente del ADN nuclear de la bacteria, normalmente aparecen múltiples copias en la célula, poseen genes de resistencia a antibióticos (marcadores) y un sitio de clonación múltiple.

pBR322. Es el primer plásmido usado de forma popular. Procede de la fusión de tres plásmidos: de uno coge la resistencia a ampicilina, del otro la resistencia a tetraciclina y del plásmido ColE1 coge el OriC. Como no tiene sitio de clonación múltiple, las dianas de restricción están dentro de los genes marcadores (resistencias), de manera que, si por ejemplo metemos nuestro gen de interés en la resistencia a amp mediante el uso de enzimas de restricción y ligasas, distinguiremos las bacterias transformantes de las no transformantes sembrando en placas con y sin ampicilina (las bacterias que hayan incorporado el fragmento no tienen el gen de resistencia a ampicilina funcional y morirán cuando las siembren en ese medio). Control del número de copias de ColE1. Alrededor del OriC se sintetizan dos tipos de ARN que participan en la regulación y síntesis de copias del plásmido. Si hay poca cantidad de plásmido, el ARN 2 funciona como cebador de la polimerasa y a partir de él se sintetiza el plásmido. El ARN1 controla la multiplicación del plásmido, cuando hay mucha cantidad de plásmido, también hay mucha cantidad de ARN 1 y éste secuestra al ARN 2 impidiendo que se replique más el plásmido (no deja que el ARN 2 funcione como cebador de la polimerasa). La proteína Rop estabiliza la interacción entre el ARN 1 y el ARN2. Este sistema de control hace que el OriC de ColE1 se siga empleando en los plásmidos. Sitios de control del numero de copias Los plásmidos son replicones, es decir, unidades de replicación autónoma, pero ello no significa que codifiquen toda la maquinaria para su propia replicación. De hecho, la mayoría de los plásmidos sólo codifican unas pocas proteínas para este fin, y aprovechan la maquinaria de replicación de la bacteria huésped (ADN polimerasas, ligasas, primasas, etc), que actúa sobre unas secuencias del plásmido denominadas secuencias oriV, donde tiene lugar el inicio de esa replicación. Aquellos plásmidos que usen la misma maquinaria de replicación celular pertenecen a un grupo de incompatibilidad. En una bacteria transformada con dos plásmidos que sean del mismo grupo de incompatibilidad observamos en su descendencia que, tras varias generaciones, sólo poseen un tipo de plásmidos. Además, la regulación del número medio de copias de cada plásmido en cada bacteria es una propiedad característica, dependiente de cómo se controla el inicio de replicación, siendo diferentes los mecanismos en los plásmidos de alto número de copias (con control relajado) y en los plásmidos de bajo número de copias (de control estricto). pUC18/19. Posee un gen de resistencia a ampicilina, el promotor de ColE1 con una mutación que aumenta el nº de copias y un MCS dentro del gen lacZ. La mutación en el OriC está en una secuencia de las que interacciona entre el ARN 1 y el ARN2 lo cual hace más inestable la unión entre ambos. El operón lac está compuesto por el gen lacZ (gen β-galactosidasa) entre otros; este operón regula la degradación de la lactosa. Cuando no hay lactosa en el medio, se expresa el promotor que produce un represor que se pega en el operador del gen lacZ, de manera que éste no puede expresarse. Determinadas moléculas derivadas de la lactosa (alolactosa o IPTG) se pegan al represor que está en el operador y libera a este último de manera que el gen lacZ puede expresarse. El gen lacZ codifica el enzima β-galactosidasa que cataliza la reacción de hidrólisis de la lactosa o, en su defecto, del análogo X-gal. La hidrólisis del X-gal produce un compuesto que al oxidarse se ve de color azul. Además, en el plásmido sólo está un pedazo del gen que codifica la β-galactosidasa (el fragmento α) por aquello de ahorrar espacio, por tanto, en presencia de IPTG lo que hacemos es secuestrar el represor permitiendo la expresión del fragmento α. La E.Coli con la que estemos trabajando produzca el resto de la proteína βgalactosidasa (restauración de α).

Cuando introducimos el fragmento de ADN en el MCS, se verá la colonia blanca (no funciona el gen lacZ), no obstante, si el fragmento es pequeño y está en fase con el gen puede haber expresión del fragmento α aunque la actividad se vea mermada. Puesto que todas las Coli silvestres tienen el operón lac, si queremos usar el vector pUC debemos modificarlas quitándoles el operón lac que está en el genoma y añadiéndole el gen que codifique la parte complementaria a la α del gen lacZ. Plásmido Bluescript II. Tiene muchos más sitios de restricción en fase con el gen lacZ, sitios de reconocimiento de la polimerasa de ARN de fago T3 y T7 y origen de replicación de fago monocatenario (f1) que al expresarlo proporciona ADN de cadena sencilla + ò – según la dirección de fabricación de la cadena. 2. Fagos Son virus que infectan exclusivamente a bacterias, y están constituidos por una cubierta proteica o cápsida en cuyo interior está contenido su material genético. Los fagos utilizados como vectores de clonación son derivados del fago Lambda. Ciclo de vida del fago lambda. El fago pica la bacteria y le mete el ADN bicatenario lineal. Una vez dentro de la bacteria, el ADN se recirculariza por las secuencias cos. Cuando las bacterias no están en condiciones totalmente óptimas, se produce el ciclo lisogénico en el que se integra el genoma vírico dentro del de la bacteria por los sitios attB y attP. En condiciones de crecimiento bacteriano, se da el ciclo lítico en el que el ADN vírico se replica bidireccionalmente y se multiplica por círculo rodante. Estas moléculas de ADN se empaquetan en la cápsida, para ello la proteína encargada en encapsidar corta cada dos secuencias cos generando extremos cohesivos. La utilidad de este sistema de empacaje es que se puede meter ADN exógeno en la cápsida siempre que esté entre secuencias cos y, en total, no se supere las 35-52kb de tamaño. Por tanto, para usar el fago como vector hay que solucionar el problema de la escasez de espacio para meter tu propio ADN, para ello se le han quitado los enzimas que producen el ciclo lisogénico (genes para la integración). A partir del fago λ surgen dos tipos de vectores: los vectores de inserción y lo de remplazamiento. a). Vectores de inserción. Para construir un vector de inserción de lambda, quitamos la región no esencial dejando la secuencia en unas 35-40kb. Nuestro fragmento de ADN de interés entrara en el MCS del ADN del fago λ mediante el corte del genoma de λ con enzimas de restricción y la introducción de mi fragmento con ligasas. El gen favorito tiene un tamaño máximo de 17kb. Puesto que hemos quitado los genes del ciclo lisogénico para ganar espacio, estos vectores no sirven para expresar el ADN (la bacteria muere) sólo para amplificarlo. Para meter tu ADN en el fago hay que purificar previamente el material vírico (viene encapsidado) usando, por ejemplo, fenol-cloroformo.

cos

cos MCS

Tras la infección, cuando ves las calvas de lisis (colonias muertas) estas pueden tener el genoma vírico restaurado o el genoma vírico con tu gen favorito incluido. Podemos distinguir entre ambos casos con el empleo del gen lacZ, al virus le ponemos el fragmento α del gen lacZ con el MCS en medio, si entra nuestro gen de interés el lacZ no se expresa y la calva se ve blanca; sin embargo, si el virus reconstituye su genoma, la calva se ve azul por la correcta expresión de la β-galactosidasa. b). Vectores de remplazamiento. Se fabrica un virus con dos MCS y, en medio, un fragmento de ADN que no sirve para nada (sólo para que alcance el tamaño de las 35kb). Los genes importantes para el virus están a izquierda y derecha del MCS. A continuación, remplazamos los genes stuffer (los que sólo servían para alcanzar el tamaño) por el fragmento de ADN que nos interesa, para ello cortamos por los MCS liberando los brazos izquierdos, derechos y el “ADN stuffer”y ponemos ADN de interés en el medio. 

Posibilidades en la ligación: - brazo izdo+brazo dcho. Es muy pequeño por lo que no encapsidaría - brazos+fragmento de ADN. Encapsida - brazo izdo+brazo izdo (2x19,3). Aunque tenga el tamaño para encapsidar no se replicaría pues le faltan los genes del brazo derecho. 3. Cósmidos Consiste en un plásmido al que le han integrado determinadas secuencias del fago lambda (sitios cos). a). Cósmidos con un solo sitio cos. Puede cortarse y linearizarse. La técnica que suele emplearse es la linearización de multitud de cósmicos, los cuales se ponen en presencia de nuestro ADN de interés y se realiza la reacción de ligación. El ADN comprendido entre las secuencias cos se puede encapsidar in Vitro con cápsidad y colitas, de manera que el fago infecta a Coli, en cuyo interior el ADN recircularías y queda como plásmido. Productos de la ligación que no nos interesan: - Cósmidos ligados que no han incluido el fragmento de interés. No van a encapsidarse pues no llegan al tamaño mínimo. - Cósmidos en los que se han pegado dos fragmentos de ADN (uno detrás de otro). Puesto que los cósmidos

se utilizan para secuenciar el genoma (la solapación entre las secuencias recogidas en los cósmidos determina el orden de los genes) no queremos que en un mismo cósmico se nos peguen dos fragmentos de ADN que no vayan el uno detrás del otro en el cromosoma del organismo silvestre pues esto nos falsearía la secuenciación. Para evitarlo tratamos los fragmentos de ADN genómico con fosfatasa alcalina. Si se unen dos cósmicos y si dan el tamaño suficiente podrían empaquetarse. Para evitarlo cortamos el cósmido con dos tipos distintos de enzimas de restricción (Hind III y Sal I), por lo que tendríamos dos tipos de cósmidos con extremos distintos y tratamos con fosfatasa alcalina. A continuación cortamos el fragmento de ADN genómico con un enzima compatible a Ban HI (Sau 3ª) y lo tratamos con fosfatasa alcalina y, por otro lado, cortamos ambos tipos de cósmidos con Ban HI. Si se uniesen los cósmidos después de haber sido tratados con ambas enzimas, no darían el tamaño suficiente y no se empaquetaría el material.

Sau 3A Sau 3A Ban HI

Ban HI

b). Cósmidos con dos sitios cos (supercósmidos). Estrategia de uso: cortamos con XbaI y tratamos con fosfatasa alcalina. Después digerimos con Ban HI y se desprende uno de los sitios cos del vector. Echamos ADN genómico cortado con Sau3A y desfosforilado y esperamos que ligue con los sitios Ban HI, por lo que quedaría entre el cósmido y el fragmento cos que se había desprendido. Como hemos apuntado antes, los cósmidos se han empleado para secuenciar ADN genómico. Para hacerlo se cogen fragmentos grandes del genoma, se introducen en los cósmidos y estos se secuencian. Normalmente se busca la complementación de función. Para meter un cósmido bien se le pone una microinyección de ADN con el gen de la GFP en la gónada, bien se bombardea el ADN mojado con partículas de oro a mamá gusano esperando que alguna quede en la gónada. Aunque el cósmido no tiene origen de replicación específico de la especie, determinadas especies lo replican. Desventajas de los cósmidos: - Tamaño de inserto limitado por el fago

- Inestabilidad (fenómenos de reordenación génica). Al tener muchas copias de cósmidos con un origen de replicación de plásmido salvaje (replica fragmentos cortos) y el tamaño de tu fragmento es muy grande, se producen errores como recombinaciones, delecciones, etc. Además, si dejas mucho tiempo el cósmido en la bacteria, al final no tendrías el cósmido original sino uno producto de recombinaciones (todos tienen secuencias muy parecidas) más favorable. La solución al problema sería ponerle un Ori que determinase pocas copias del plásmido. 4. BACs Provienen de otro plásmido distinto de Col E1, el plásmido F (da capacidad de conjugación a las bacterias). En general tenemos una copia por bacteria (sistema muy regulado de replicación) por lo que evita los problemas de reordenación génica. Generalmente consta de: - Genes tra: codifican proteínas responsables de la formación del pili de conjugación. - OriF: origen de transferencia del plásmido F que solo se activa en el momento de la conjugación y no de la replicación. Es sitio de corte de la endonucleasa para transferencia de la cadena del plásmido. - Genes par: codifican microtúbulos que participan en la segregación del plásmido F (actúa como centrómero), también mantienen el número de copias del plásmido. - Genes rep y Ori 2: origen de replicación del plásmido y control de replicación. Para usarlo como vector lo único que necesitamos es el control de replicación, los genes par y el ori. Esto es el plásmido miniF, el cual controla su replicación y su segregación. Para la construcción del BAC, partimos del miniF y le añadimos una resistencia a antibióticos, un sitio de clonación múltiple y el gen lacZ (el fragmento α). Las ventajas del uso de BAC son: -Bajo número de copias (1-2/cel). Se reduce la recombinación entre plásmidos -Genes par que aseguran el correcto reparto a las células hijas en la división celular -Permite la clonación de fragmentos grandes (150-300kb) -Fácil de manipular. Transformación por electroporación. Se aislan por métodos convencionales de lisis alcalina y unión a filtros. Mientras que los inconvenientes son la dificultad de ligar un fragmento tan grande con el plásmido y la fragilidad del vector (no pipetear, no agitar fuerte…) 5. Fósmidos Son combinaciones del factor F y del cósmido, por lo que tiene las mismas ventajas de los cósmidos y se antepone al problema del número de copias. Los fósmidos con dos sitios cos, se trabajan igual que los cósmidos con dos sitios cos, la diferencia es que cuando se encapsidan, pierden el origen de replicación del cósmido y se quedan con el OriF. El principal problema de este sistema vuelve a ser el tamaño, está limitado debido a la encapsidación en el virus.

Una ventaja de los fósmidos en la fabricación de genotecas es el encapsulamiento en el fago λ, que aumenta la eficiencia de clonación y transformación y su estabilidad

6. Bacteriófago P1 En el ciclo de vida del fago P1 distinguimos por un lado el ciclo lítico y por el otro el lisogénico: - Ciclo lisogénico. El ADN no entra en el genoma bacteriano sino que tiene un sistema de control de copias muy refinado. Sistema par (similar a microtúbulos) y origen de replicación con pocas copias (replicón R). - Ciclo lítico. Posee un origen de replicación distinto y se replica por el método del círculo rodante. Para encapsidar se reconoce la secuencia pac y se empaqueta 110kb a partir de ella, el ADN se encuentra lineal dentro de la cápsida. Cuando se introduce el material genético en la bacteria, para recircularizarlo utiliza las secuencias lox-P y la recombinasa Cre (debe tenerla la bacteria).

Vector derivado del fago P1 - Origen, sistema de replicación del ciclo lisogénico del fago P1 y sistema de segregación (pocas copias, genes par y replicón R) - Origen de replicación del ciclo lítico (se induce por IPTG, normalmente está silenciado) - Secuencias loxP - Secuencia de encapsidación pac clonada direccionalmente para que se empaquete el DNA en el sentido contrario a las agujas del reloj. - Stuffer: ADN de relleno (da el tamaño) - Origen de replicación de plásmido. Permite que el plásmido replique, gana a los otros. - Resistencia (ej. Kan) - Sac B. Gen con sitio de clonación múltiple dentro (en presencia de sacarosa produce un producto tóxico para la bacteria). El promotor de SacB está separado del gen por el MCS, poniendo azúcar en el medio vemos si se ha metido algún fragmento de ADN en el vector porque la bacteria no moriría (no se expresa sacB). Trabajar con P1 1. Multiplico el plásmido en bacterias utilizando el ori pBR322 2. Purifico plásmido 3. Cortamos con ScaI 4. Cortamos con Bam HI

5. Defosforilamos el extremo del plásmido cortado con ScaI y el ADN genómico ya digerido. 6. Ligamos el ADN de interés cortado con enzima que deje extremos compatibles con Bam HI. 7. Empaquetamos en la cápsida (de pac en adelante 110kb) 8. Transfectamos en bacteria Cre+ (el genoma recirculariza dentro de la bacteria y queda lo que había entre los dos sitios loxP, de manera que perdemos el ori pBR322 quedándonos con el ori del ciclo lisogénico que hace pocas copias). 9. Seleccionamos los resistentes a kan Ventajas de P1 - Clonar fragmento de 70 – 90 kb. - Alta eficiencia de clonación y transformación. - Selección de vectores ligados a inserto (marcador de contraselección). - Estabilidad. 7. PACs (derivado de P1) Fusión entre el plásmido pUC19 (aporta un origen de replicación de muchas copias, col E1, y la resistencia a ampicilina) y el vector P1. Esto aumenta el tamaño del inserto (prescinde de la encapsulación en partículas virales), se transforma por electroporación y disminuye la toxicidad del gen SacB. Trabajar con PAC: 1. Cortamos el vector con Bam HI deshaciéndonos del fragmento de pUC19 mediante columnas de purificación 2. Defosforilamos los extremos Bam HI del vector 3. Ligamos ADN genómico cortado con extremo compatible a Bam HI. 4. Seleccionamos en presencia de Kanamicina y sacarosa Caben más kb porque no hay que empaquetar dentro del fago, no obstante, a mayor cantidad de ADN genómic...