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3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV

CÁNCER

TEMAS 28 y 29 Resistencia a la apoptosis y cáncer Desde hace ya tiempo, se sabe que la apoptosis y, en concreto su desregulación, es un fenómeno

altamente implicado en cáncer. En el siguiente esquema tenemos una línea temporal de los descubrimientos relativos a la apoptosis desde el descubrimiento de este proceso. La apoptosis se descubrió como un tupo de muerte que aparecía durante el desarrollo embrionario.

Se ha ido viendo que hay muchos genes que regulan la apoptosis que se encuentran alterados en el cáncer. La alteración de estos genes, confiere a la célula neoplásica la propiedad de resistencia a la

apoptosis, que es una de las características fundamentales de las células tumorales incluidas dentro de los Hallmarks del cáncer propuestos por Weinberg. La evasión de la apoptosis permite a la célula tumoral superar las adversidades y problemas frente a los que se encuentra.

VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE LA APOPTOSIS Debemos recordar que existen dos vías de señalización que conducen a la apoptosis de las célula, la vía mitocondrial o intrínseca, que es inducida cuando la célula sufre un daño importante, y la vía extrínseca (o de receptores de muerte) cuyo inicio está más regulado y depende de la unión de un

ligando a un receptor específico. Vía extrínseca Esta vía es iniciada por los receptores de muerte, que se localizan en la membrana plasmática de las células. El inicio de esta vía está más regulado que el de la vía intrínseca ya que depende de la unión de un ligando a un receptor específico (en cambio, la vía intrínseca depende de que se produzca un daño celular grave, que puede ser de origen variado). Los receptores de muerte pertenecen a la familia de los receptores de TNF que, por tanto, es su ligando. También encontramos el receptor de Trail y su ligando.

Vía intrínseca o mitocondrial Esta vía de apoptosis se inicia desde la mitocondria, que es el elemento central del comienzo de la muerte celular mediante este mecanismo. La célula sufre una lesión que, en un principio es reversible, pero se convierte en irreversible cuando se supera cierto umbral

de daño. En este caso, la única solución para la célula es la muerte programada, por lo que inicia el proceso de apoptosis por la vía intrínseca. 1

CÁNCER Curso 2015/2016 A continuación, vamos a ver los mecanismos de ambas vías de señalización.

VÍA EXTRÍNSECA Como ya hemos dicho, esta vía depende de la unión específica de un ligando a un receptor de muerte. Una vez se ha producido esta unión, el receptor dimeriza y recluta a la proteína FADD . FADD a su vez, recluta a otra proteína, una caspasa. Las caspasas son cisteína proteasas y son las principales ejecutoras de la apoptosis. En estado inactivo se encuentran en forma de pro-caspasa. La unión a FADD hace que se active la actividad proteolítica de la caspasa que, lo primero que hace es autoproteolizarse para dar lugar a la caspasa activa. Son las

caspasas 8 y 10 las principales iniciadoras de la apoptosis por vía extrínseca, es decir, son las caspasas que primero se activan. Una vez activa, la caspasa iniciadora proteoliza a la pro-caspasa 3 (inactiva), que se convierte en la caspasa 3 activa que ya es una caspasa ejecutora. La caspasa ejecutora proteoliza diferentes sustratos que son los responsables de las características morfológicas y bioquímicas de la muerte apoptótica.

Regulación de la vía extrínseca La proteína FLIP es el principal elemento regulador de la apoptosis por vía extrínseca. Tiene un elevado grado de homología con la caspasa 8 pero no tiene actividad proteolítica. Por tanto, si tenemos altos niveles de FLIP, ésta compite con la pro-caspasa 8 por la unión a FADD, desplazando a la caspasa e impidiendo su unión (y, por tanto, su consiguiente activación).

VÍA INTRÍNSECA Esta vía se inicia como consecuencia de un gran daño celular que no puede ser reparado, como por ejemplo, daño irreversible en el DNA. La salida del citocromo C de la mitocondria es la responsable del comienzo de la apoptosis. Lo que ocurre es que, como consecuencia del daño celular, se abren poros en la membrana de la mitocondria permitiendo la salida del citocromo C. Dos proteínas, Apaf 1 y la pro-caspasa 9, que es la iniciadora de la apoptosis por esta vía, se asocian al citocromo C, formando el complejo conocido como apoptosoma. En el apoptosoma, la pro-caspasa 9 activa su actividad proteolítica, y se autoproteoliza, convirtiéndose en caspasa 9 activa. Ésta proteoliza y activa a la caspasa 3, que es la caspasa ejecutora . Como podemos recordar, la caspasa 3 es también la caspasa ejecutora de la vía extrínseca, por lo que ambas vías convergen en este punto y tienen la misma consecuencia.

Regulación de la vía intrínseca Los reguladores de la apoptosis por la vía intrínseca son los miembros de la familia de Bcl2 que pueden ser pro-apoptóticos o anti-apoptóticos. Los miembros pro-apoptóticos, como Bax y Bak, se encargan de facilitar la salida de citocromo C de la mitocondria mediante la formación de canales en su membrana. Por otro lado, los miembros anti-apoptóticos de la familia de Bcl2, como Bcl-XL o el propio Bcl2, se encargan de secuestrar a los factores pro-apoptóticos impidiendo que realicen su función.

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Además, la apoptosis tiene niveles más finos de regulación, que son las IAPs. Estas proteínas inhiben la apoptosis ya que inhiben directamente a las caspasas en el citosol. Podemos encontrar IAPs para todas las caspasas. Por tanto, para que la activación de las caspasas sea posible, es necesario que otras proteínas inhiban a las IAPs. Cuando la célula recibe señales de estrés, junto con el citocromo C salen otras proteínas de la mitocondria, como las proteínas SMAC/Diablo o las proteínas OMIS. Estas proteínas inhiben a las IAPs permitiendo la liberación de las caspasas. Las activación de las vías intrínseca y extrínseca no es del todo independiente ya que existe un mecanismo de Crosstalk entre ambas vías de activación de la apoptosis, que tiene lugar gracias a la proteína Bid. La caspasa 8 activa procesa a Bid que se activa y se dirige a la mitocondria, donde promueve la salida

de citocromo C y de las proteínas SMAD/Diablo y las OMIS. Este mecanismo es conocido como la amplificación mitocondrial de la vía activada por receptores de muerte. Se cree que la amplificación mitocondrial ocurre en aquellas células con una cantidad de caspasa 8 limitada, que no es suficiente para activar la apoptosis por sí sola y que, por tanto necesita la ayuda de la vía mitocondrial (la caspasa 8 no es capaz de proteolizar suficientes proteínas). A continuación tenemos un esquema que resume ambas vías de señalización de la apoptosis, así como los mecanismos de regulación y de Crosstalk.

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ALTERACIONES DE LA APOPTOSIS EN CÁNCER Como ya se ha comentado, la resistencia a la apoptosis es una de las características fundamentales que fueron propuestas por Hanahan y Weinberg dentro de lo que llamaron los hallmarks del cáncer. Podemos encontrar dos tipos de alteraciones en la apoptosis: - Alteraciones en proteínas que participan en el núcleo de la regulación de la apoptosis, ya sea en la vía intrínseca o en la extrínseca. Dentro de este grupo podemos encontrar alteraciones en las caspasas, en las IAPs, en los receptores de muerte, … es decir, en elementos de la maquinaria central de la apoptosis. - Mutaciones en otras vías de señalización que proporcionan resistencia a la apoptosis. Se trata de vías implicadas en supervivencia celular, como la vía PI3K/AKT, p53, … Si se encuentran alteradas, estas vías alteran la apoptosis upstream a la propia vía (quedan alteradas vías que no tienen que ver con la maquinaria central de la apoptosis).

Mecanismos de resistencia a la apoptosis por mutaciones en la maquinaria central En la tabla vemos que hay alteraciones que afectan a la vía extrínseca, alteraciones a la vía mitocondrial o intrínseca y alteraciones que pueden afectar a ambas vías.

En cuanto a la vía extrínseca, podemos encontrar alteraciones en los receptores de muerte, pérdida de función de las caspasas iniciadoras, o sobreexpresión del principal antagonista de la vía, que es FLIP. En cuanto a la vía intrínseca podemos encontrar alteraciones diferentes, como alteraciones en miembros de Bcl2, alteraciones en las IAPs, mutaciones en las propias caspasas de la vía intrínseca, … Además, como sabemos, existe un Crosstalk entre las dos vías. En teoría, la vía extrínseca no necesita la ayuda de la vía intrínseca pero cuando se requiere la amplificación mitocondrial, las alteraciones de la vía intrínseca repercutirán en la vía extrínseca (podrán causar resistencia a la apoptosis por este vía también).

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Vía extrínseca y resistencia a la apoptosis La apoptosis por esta vía se inicia gracias a los receptores de muerte, que pertenecen a la familia de los receptores de TNF. Se trata de proteínas transmembrana que tienen, en el interior celular, un

dominio de muerte. El dominio de muerte es esencial para la función del receptor, ya que le permite asociarse a FADD (y por tanto, permiten la transducción de la señal).

En la imagen podemos ver distintos receptores de muerte (y como todos tienen este dominio en común). Estos receptores se unen a diferentes ligandos, como TRAIL, que puede unirse a más de un receptor.

Principales mecanismos de resistencia: - Alteración de los receptores de muerte - Sobreexpresión de FLIP - Pérdida de función de la caspasa 8

Una de las funciones fisiológicas de la apoptosis por la vía extrínseca es el mantenimiento de la

homeostasis de los linfocitos T . Cuando se detecta un antígeno en el organismo, se activa la respuesta inmune específica con su consiguiente proliferación de linfocitos T pero, una vez se ha eliminado el antígeno, los linfocitos activados son eliminados por reconocimiento mutuo. Los linfocitos activos "que sobran" (ya que ha habido una producción masiva y no han hecho falta todos para eliminar el antígeno) comienzan a expresar Fas ligando en la membrana, que es reconocido por el receptor de

Fas que se encuentra en la membrana de las células. No se sabe si ocurre exactamente así pero lo más probable es que el receptor de Fas ligando se exprese de manera constitutiva en los linfocitos. De esta manera, se produce un reconocimiento mutuo entre Fas y Fas ligando de las membranas y los linfocitos experimentan un proceso de apoptosis.

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CÁNCER Curso 2015/2016 Mutaciones en genes que controlan la apoptosis por la vía extrínseca de los linfocitos causan patología

autoinmune linfoproliferativa que desencadena en el desarrollo de linfomas. Son mutaciones en el ligando (Fas), en el receptor o en las caspasas iniciadoras que causan una supervivencia excesiva de los linfocitos T.

En los últimos años, la apoptosis por la vía extrínseca se ha convertido en uno de los objetos de

terapias para inducir la muerte celular de las células tumorales. Las terapias clásicas, como la quimioterapia o la radioterapia, ya tienen como objetivo la activación de la apoptosis, en este caso de la vía intrínseca ya que inducen daño en el DNA que activa la muerte programada. El objetivo actual es si es posible activar de alguna manera los receptores de muerte para activar el proceso de muerte programada por la vía extrínseca en las células tumorales (de manera específica). Se ha intentado provocar la muerte apoptótica de las células tumorales mediante varios mecanismos. En primer lugar, se probó inyectando TNFα. Esto no resultó un buen método ya que se trata de una citoquina pro-inflamatoria muy potente que acababa simulando una sepsis (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica) que acababa con la muerte del paciente. También se intentó con Fas ligando, que fue el 2º miembro de la vía que se descubrió, inyectando anticuerpos agonistas de Fas ligando a ratones. Entre 6 y 12 horas tras la inyección, los ratones comenzaban a morir. Estos se debía a que hay células, como los hepatocitos, que tienen receptores de

Fas muy sensibles a este ligando. Por tanto, al inyectar el agonista se producía la muerte masiva de hepatocitos.

Parece que la gran promesa es la administración de TRAIL. Fue este artículo el primero que propuso TRAIL como posible terapia. En este estudio se inyectó TRAIL en animales experimentales a los que se había inyectado un tumor subcutáneamente y se observó que este logando mataba selectivamente a

las células tumorales y no a las normales. Por este hecho se pensó que podría ser un antitumoral y llegar a convertirse en una gran terapia contra el cáncer. 6

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Además, TRAIL no presentaba toxicidad hepática ni pulmonar ni inducía una inflamación exagerada. Por tanto, TRAIL se propuso como un potencial agente antitumoral. Más tarde, se desarrollaron fármacos más finos como

anticuerpos agonistas contra el receptor de TRAIL, que eran más específicos o la administración del propio TRAIL conjugado con células del sistema inmunitario para incrementar la eficacia de la respuesta. Se han ido desarrollando muchos fármacos que se encuentran en diversas fases de ensayo clínico. No hay muchos fármacos de estos que se encuentren en fase III ya que, desgraciadamente, la mayoría

de ellos no han obtenido respuesta en los ensayos clínicos . Como podemos comprobar en la siguiente tabla, en cuanto a la seguridad los fármacos han ido bastante bien ya que no presentan toxicidad extrema pero la gran mayoría no presenta respuesta o solo responde en unos casos muy concretos.

Estos ensayos clínicos se han llevado a cabo tras probar la eficacia de los fármacos en líneas tumorales, en las que sí han resultado ser buenos antitumorales. No se sabe por qué no funcionan bien in vivo. Ante el no funcionamiento de TRAIL se han planteado que esto puede deberse a que las células tumorales tienen mecanismos de resistencia. Si los receptores están alterados o FLIP está sobreexpresado, a pesar de que aumentemos la cantidad de ligando de los receptores, no se producirá apoptosis. Esta es una de las posibles explicaciones de por qué no funciona TRAIL como tratamiento.

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CÁNCER Curso 2015/2016 En la siguiente imagen podemos ver todas las proteínas cuya alteración provoca resistencia a la muerte inducida por TRAIL.

Las células tumorales desarrollan mecanismos de resistencia a la muerte inducida por receptores (vía extrínseca) que pueden contribuir al desarrollo del tumor y que pueden dar resistencia a las terapias. A continuación se van a explicar las diferentes alteraciones que pueden producirse en diferentes elementos de la vía extrínseca que ya han sido comentados anteriormente.

- Alteración de la expresión de receptores Una expresión alterada de los receptores de muerte podría ser uno de los motivos por los cuales TRAIL como terapia no resulta funcional. TRAIL puede unirse a cinco receptores diferentes, de los cuales solo DR4 (TRAIL-R1) y DR5 (TRAIL-R2) tienen dominio de muerte en el interior celular y por tanto, solo estos dos resultan funcionales. Los otros tres receptores de TRAIL son los decoy receptors, que no son capaces de inducir la apoptosis.

La molécula de TRAIL inducirá la apoptosis solo si se une a DR4 o a DR5. Como los decoy receptors (DcR1, DcR2, OPG) no son capaces de activar la muerte apoptótica, compiten

con los receptores funcionales por la unión al ligando TRAIL. En caso de que haya sobreexpresión de los receptores decoy , la mayoría del TRAIL se unirá a estos y no se activará la apoptosis. Por tanto, una sobreexpresión de los receptores decoy constituye un primer mecanismo de resistencia. A continuación vemos un estudio en el que se ha analizado la expresión de los decoy receptors en el epitelio tumoral, en muestras de carcinoma de endometrio. Vemos que en el epitelio tumoral hay una expresión muy elevada. Además, cuanto más agresivo es el tumor y mayor es el estadiaje, podemos encontrar más receptores decoy en la superficie de las células. 8

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La cantidad de decoy receptors que exprese la célula tumoral tiene implicaciones a nivel terapéutico ya que, como ya se ha comentado constituyen un mecanismo de resistencia a la terapia con TRAIL. Como se trata de una inhibición competitiva de la apoptosis, aumentar la dosis de TRAIL aumentaría los niveles de muerte apoptótica pero la dosificación tiene un límite por lo que no es posible aplicar una cantidad de TRAIL suficiente como para que haya apoptosis a pesar de los decoy receptors. Se ha intentado con la administración de anticuerpos monoclonales agonistas específicos para los receptores de TRAIL 4 y 5, que sí son capaces de activar la apoptosis.

- Sobreexpresión de FLIP FLIP es el principal antagonista de la apoptosis por vía extrínseca, por lo que su sobreexpresión constituye otro mecanismo de resistencia a la terapia con TRAIL. Es decir, puede ocurrir que la terapia con TRAIL no funciona por el desarrollo de mecanismos de resistencia downstream al receptor. Podemos encontrar diferentes isoformas de FLIP: S, L y R, que son formas celulares, y también formas virales ya que FLIP es uno de los oncogenes incorporados por algunos virus a su genoma tras la inserción.

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CÁNCER Curso 2015/2016 Por ejemplo, el virus del sarcoma de Kapossi tiene FLIP incorporado en su genoma por lo que, si infectamos un cultivo celular con el virus es posible que este transforme las células. La sobreexpresión de FLIP constituye un mecanismo de oncogénesis viral.

Se ha comprobado mediante inmunohistoquímica que la forma celular de FLIP se encuentra sobreexpresada en muchos tumores.

Parece que las diferentes formas de FLIP no actúan todas de la misma forma. Todas las formas compiten

con la caspasa 8 por su unión a FADD aunque se ha visto que la regulación ejercida por FLIP no es solo de tipo competitivo.

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Además, FLIP se encuentra muy regulado tanto a nivel transcripcional como a nivel post-

transcripcional. A nivel transcripcional, se han descrito gran cantidad de factores de transcripción y de vías de señalización capaces de promover e inhibir la expresión de FLIP. La regulación de FLIP a nivel transcripcional es, por tanto, muy complicada. Dentro de la regulación post-traduccional de FLIP encontramos que las diferentes isoformas tienen múltiples residuos que pueden ser modificados. Por ejemplo. tiene residuos ubiquitinizables gracias a los cuales FLIP puede ser degradado por el proteasoma. La regulación posttraduccional de FLIP también puede modificar su afinidad por FADD.

No se conocen muy bien las consecuencias de la modificación posttraduccional de FLIP ni hasta qué punto cada modificación es importante. Sí que se sabe que FLIP tiene un recambio o turnover corto , es decir, que se sintetiza y se degrada vía proteasoma muy rápidamente. Parece que existen una serie de ubiquitin ligasas, como Itch, que participan en este turnover pero tampoco se conoce cuál es exactamente el impacto de estas en las cantidades totales de FLIP en la célula ni su relación con el cáncer.

- Pérdida de función de la caspasa 8 o caspasa iniciadora Se trata de la tercera que se conoce de desarrollo de resistencia a la terapia por TRAIL. En la siguientes tablas podemos ver todos los cánceres en los que se han encontrado mutaciones en las caspasas.

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Como podemos comprobar, se trata de mutaciones muy variadas y no demasiado frecuentes, por lo que no se les presta mucha atención en el diagnóstico.

Vía extrínseca como diana terapéutica Una vez conocemos los posibles mecanismos de resistencia que la célula...