Tinción negativa - Apuntes 2 PDF

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TINCION negativa para presentar...

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Tinción negativa Utiliza colorantes neutros o ácidos ya que tienen poca afinidad por la celula bacteriana

Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea.5 Adicionalmente, la tinción negativa es una técnica suave que no destruye a los microorganismos, permitiendo por lo tanto un recultivo posterior para el estudio de patógenos. Tinción negativa es una técnica de microscopía que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.1 En caso de microscopía electrónica de transmisión, se emplean sustancias de alto número atómico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Típicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al electrónico, esta técnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamaño. La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

La tinción negativa es un método de coloración especial para destacar la presencia de la cápsula en algunos microorganismos —principalmente Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae y Cryptococcus neoformans—, provenientes de muestras clínicas o de cultivos puros. La muestra directa comúnmente utilizada para aplicar tinción negativa es el líquido cefalorraquídeo. Esta técnica representa una alternativa rápida para el diagnóstico presuntivo de meningitis, especialmente por Cryptococcus neoformans. Así mismo, esta tinción puede ser aplicada sobre esputo y líquidos estériles en general, así como también sobre cepas obtenidas de cultivos puros jóvenes. Esta técnica utiliza nigrosina o tinta china para su ejecución; por tanto, es una metodología muy sencilla y económica de aplicar que brinda información de gran valor diagnóstico en poco tiempo. En este sentido, cualquier laboratorio está en la capacidad de realizar esta coloración. Claro está, el laboratorio debe contar con un personal competente, capaz de reconocer las levaduras del Cryptococcus neoformans aislado o en gemación y diferenciarlas de leucocitos y artefactos que pueda presentar la muestra. Materiales

Nigrosina La nigrosina debe su nombre al color negro que posee. Es una sustancia sintética que se obtiene del calentamiento de la mezcla de compuestos orgánicos —tales como la nitrobencina, la anilina y el hidroclorito de anilina—, utilizando en dicha reacción un catalizador (hierro o cobre).

Tinta china La tinta china es una sustancia utilizada principalmente por los asiáticos para la escritura, la elaboración de obras de arte y la pintura monocromática. Es muy popular en la cultura china.

Se obtiene de la tinta del calamar mezclada con carbón pulverizado, producto de la quema de árboles poco resinosos.

También es posible prepararla a partir del hollín de la incineración de hidrocarburos (aceites vegetales), junto con una gelatina proteica que le da la consistencia adecuada para evitar la precipitación de las partículas de carbón.

Especificaciones para la toma de muestra

– No requiere ayuno.

– La muestra de LCR, esputo o líquido estéril debe contener al menos 1 ml de volumen y debe ser trasladada a temperatura ambiente al laboratorio de forma inmediata.

– Las muestras de LCR y líquidos estériles deben ser tomadas por un médico especializado.

– También puede ser un cultivo puro de una cepa sospechosa vinculada con los patógenos ya mencionados.

Ejecución de la técnica con muestras directas

– Las muestras deben ser centrifugadas, luego se descarta el sobrenadante y se toma el sedimento.

– En una lámina portaobjeto limpia se coloca una gota del material centrifugado (sedimento) y una gota de tinta china o nigrosina.

– Debe mezclarse bien y cubrir con una lámina cubreobjeto, dejando que la gota se extienda como una película fina sin que rebase los bordes.

– Posteriormente se monta la preparación en el microscopio.

– Si la preparación queda muy oscura, se puede diluir con agua.

Ejecución de la técnica con cepas provenientes de cultivo

– Se toma una porción muy pequeña de un cultivo joven con una aguja de sembrado y se disuelve en una gota de tinta china colocada previamente sobre un portaobjeto limpio.

– Se coloca un cubreobjeto encima.

– Se observa en el microscopio a 10X y luego a 40X.

También puede disolverse una porción de la colonia en agua destilada, y de allí tomar una gota y mezclarla con la tinta china. De esta manera el preparado no quedará tan grueso, haciendo posible la observación de las estructuras en forma aislada; si hay aglomeraciones, no se observará bien.

Otra metodología es la siguiente:

– Colocar una gota del cultivo en suspensión en un extremo del portaobjeto.

– Colocar una gota de nigrosina en el mismo extremo y mezclar.

– Con ayuda de otro portaobjeto, extender la muestra como si se estuviese haciendo un frotis hematológico.

– Dejar secar y observar en el microscopio.

Observación en microscopio

Primero se debe enfocar con objetivo de 10X para tener una visión amplia del campo. Posteriormente se debe buscar si hay espacios claros; si los hay, enfocar con 40X para ver los detalles.

Ventajas

– Es fácil de ejecutar.

– Es una técnica económica.

– Este método no requiere que el frotis sea fijado al calor ni con productos químicos; por lo tanto, los microorganismos son observados sin distorsiones.

– La preparación en fresco no necesita ser secada, por lo que se puede observar inmediatamente, generando resultados de forma rápida.

Desventaja

Una vez montadas, las preparaciones en fresco deben ser observadas inmediatamente; si se dejan secar ya no es posible observarlas y se deberá montar una nueva.

Tinción de tejidos con tinta china

Otra función que puede cumplir la tinta china es en los laboratorios de patología. Esta se aplica en muestras de tejido extraídas quirúrgicamente con la finalidad de marcar los márgenes de resección del tumor.

El tejido marcado se rocía con ácido acético. Este actúa como un mordiente y evita que la tinta se salga cuando el tejido es sometido al procesamiento de rutina para el preparado de la biopsia.

El procedimiento consiste en bañar el tejido en alcohol y xileno, y luego embeber en cera de parafina. Este marcaje orienta al patólogo al momento de observar el tejido, indicándole dónde está el margen de resección quirúrgica u otro punto de interés.

Suele utilizarse microscopia de fluorescencia para obtención de imágenes de células vivas. La técnica es valiosa también para la detección de bacterias, cromosomas, componentes celulares o reacciones o interacciones antígeno-anticuerpo en muestras clínicas de origen humano. Teñir el material clínico con colorantes fluorescentes facilita el diagnóstico al destacar más las estructuras importantes cuando se examinan al microscopio. La cartera de colorantes de Merck para microscopia incluye diversos colorantes fluorescentes de gran calidad con una variedad de longitudes de onda para diferentes combinaciones de filtro. Nuestra completa gama de productos está disponible en una amplia variedad de tamaños de envase para adaptarse a todos los requisitos. Además, cada colorante fluorescente es un producto para DIV con certificación CE.

Rodamina B La rodamina B es un colorante seco utilizado para tinción fluorescente de frotis bacteriológicos y cortes de tejido histológico de origen humano para detección de Tb. El método se basa en la unión inespecífica de colorante fluorescente a un sustrato, semejante al método de Ziehl-Neelsen clásico, con la salvedad de que puede evitarse el calentamiento de la disolución de color rodamina B. Nuestro colorante rodamina B es un producto para DIV certificado por la CE que ofrece un contenido constante de colorante y una calidad uniformemente elevada para asegurar resultados diagnósticos reproducibles.

Fluoresceína-5-isotiocianato (FITC) En inmunohistología e inmunocitología, el isotiocianato de fluoresceína (fluoresceína-5-isotiocianato [FITC]) actúa como un marcador fluorescente para visualización microscópica y detección de biomoléculas unidas a los tejidos, como antígenos, lectinas, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, oligosacáridos y polisacáridos en muestras de origen humano. Anticuerpos marcados con FITC se unen de manera específica a las estructuras específicas apropiadas del tejido. Es importante una proporción FITC a proteína (anticuerpo) óptima para obtener resultados precisos.

Clasificación de células activadas por fluorescencia

La técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia FACS por sus siglas en inglés (Fluorescence-Activated Cell Sorting) es un tipo especializado de citometría de flujo. Esta técnica provee un método para la clasificación y selección de células provenientes de una mezcla de varias poblaciones en dos o más contenedores de a una célula por vez, según las características particulares de dispersión y fluorescencia de

cada célula. Es un instrumento científico de gran utilidad ya que provee un método de grabación de datos provenientes de las señales de fluorescencia de cada célula que es a la vez rápido, objetivo y cuantitativo; además permite la separación física de aquellas células pertenecientes a una población de interés. Entre la gran mayoría de los investigadores que utilizan esta tecnología ya sea para la clasificación o el análisis, este término ha pasado a ser genérico en el uso común, al igual que xerox o kleenex. El clasificador de células fue inventado por Mack Fulwyler en 1965, utilizando originalmente el principio Coulter como método de recolección de datos, una técnica relativamente difícil y que ya casi no se utiliza en los instrumentos modernos. La técnica fue ampliada luego por Len Herzenberg, quien fue el responsable de acuñar el término FACS.16 Herzenberg ganó el Premio Kioto en 2006 por su trabajo pionero en citometría de flujo. La suspensión de células es arrastrada hacia el centro de una corriente de líquido estrecha, que fluye rápidamente. El flujo está dispuesto de manera que existe una gran separación entre células en relación con su diámetro. Un mecanismo de vibración ultrasónico provoca que la corriente de líquido conteniendo las células se rompa en pequeñas gotitas. El sistema se ajusta de modo que haya una baja probabilidad de que más de una célula quede contenida en cada gota. Justo antes de que la corriente se rompa en gotitas, el flujo pasa a través de una estación de medición de fluorescencia, donde se mide el carácter fluorescente de interés de cada célula. Un anillo capaz de adquirir una carga eléctrica se coloca justo en el punto donde la corriente se rompe en gotitas. Según la medición de la intensidad de fluorescencia recogida para cada célula, el sistema entrega una determinada carga eléctrica al anillo, como consecuencia las gotitas se cargan eléctricamente con un signo contrario al del anillo mientras se desprenden de la corriente de líquido. Las gotitas cargadas luego caen a través de un sistema de deflexión electrostática que desvía las gotas en los contenedores dependiendo de su carga. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente a la corriente de líquido, y como resultado la gotita que se desprende retiene carga del mismo signo que la aplicada. Luego de que la gotita se desprende, el anillo recupera una carga neutra.

Marcadores fluorescentes Artículo principal: Fluoróforo

Se pueden utilizar un amplio rango de fluoróforos como etiquetas para el marcado fluorescente en citometría de flujo. Los fluoróforos se encuentran por lo general químicamente unidos a anticuerpos específicos capaces de reconocer una determinada molécula diana en la superficie o en el interior de la célula. Estas etiquetas fluorescentes también pueden adosarse químicamente a casi cualquier compuesto químico que presente una cierta afinidad por la membrana o alguna otra estructura celular. Cada fluoróforo posee un pico de excitación característico, y una longitud de onda de emisión también característica. Sin embargo los espectros de emisión de diferentes etiquetas con frecuencia se superponen, por consiguiente, la combinación de marcadores que pueden ser usados depende de la longitud de onda de la lámpara(s) o del láser(es) usados para excitar los fluorocromos y en los tipos de detectores que se encuentren disponibles.17 El número máximo de marcadores fluorescentes distinguibles se cree que se encuentra entre 17 o 18, y este nivel de complejidad requiere un laborioso proceso de optimización para limitar los artefactos, así como complejos algoritmos de deconvolución para separar los espectros solapados.18 Marcadores fluorescentes de unión covalente: Isoticianato de fluoresceína, picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.19

Marcadores fluorescentes de unión no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acridina, yoduro de propidio, rh12. Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente....