TP M1chimie Determination MM PDF

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TP MASTER 1 CHIMIE METHODES D'EXTRACTION 1 (ACQ/GTE/GPF/PV2R) Estimation de la masse molaire de protéines Le but de cette séance est d’estimer la masse molaire du lysozyme et de l’ovalbumine à partir de deux techniques différentes : la chromatographie d’exclusion stérique et l’électrophorèse.

REACTIFS        

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Mélange 1 (V0 et Vtotal) : bleu Dextran et vitamine B12 Mélange 2 (marqueurs MM) : BSA (66 kDa) et cytochrome C (12,4 kDa) Mélange 3 (marqueurs MM) : anhydrase (29 kDa) et aprotinine (6,5 kDa) Mélange 4 : lysozyme et ovalbumine (MMLysozyme < MMOvalbumine) Tampon d’élution (chromatographie) :Solution de NaCl 9‰ massique Résine Séphadex G75 Réactif de Bradford (bleu de Coomassie, révélation chromatographie) Tampon d’électrophorèse :  90 mM Tris base (10,90 g/L)  90 mM acide borique (5,57 g/L)  0,1 % SDS Gel d’agarose à 7 % dans tampon d’électrophorèse Tampon échantillon (dépôt électrophorèse) :  126 mM Tris-HCl (pH 6,8)  15 % Ficoll Type 400  4 % SDS  0,002 % Bleu bromophénol Tampon coloration (électrophorèse) :  40 % méthanol  10 % Acide acétique glacial  0,25 % Bleu Coomassie Tampon décoloration (électrophorèse) :  20 % méthanol  5% acide acétique glacial

MODE OPERATOIRE Changer les cônes pour chaque solution. Penser à bien homogénéiser vos dilutions au vortex. Rincer toute la verrerie utilisée à l’eau distillée avant les manipulations. Une colonne de chromatographie ne doit jamais être « à sec ». Electrophorèse – Dépôt  Préparation des marqueurs de masse molaire : ▸ Dans un tube eppendorf, mélanger 50 µL de Mélange 2, 50 µL de Mélange 3 et 100 µL de tampon de dépôt. Bien vortexer.  Préparation des échantillons : Dans un tube eppendorf, mélanger 50 µL de mélange 4 et 50 µL de tampon de dépôt. Bien vortexer.  Placer les tubes eppendorf 5 minutes à 95 °C pour dénaturer les protéines.  Déposer 50 µL de chaque échantillon dans les puits du gel d’électrophorèse.

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Faire migrer pendant 1 à 2 h à 100 V.

Electrophorèse – Révélation  Après migration, faire tremper le gel dans le tampon « coloration » pendant 1 h.  Mettre ensuite le gel à décolorer pendant 4 h. Chromatographie – Préparation  Jauger à 500 µL une vingtaine de tubes à hémolyse en marquant la hauteur de solvant à l’aide d’un marqueur. Chromatographie – Élution  Procédure générale pour chaque échantillon: ▸ Abaisser le ménisque d’éluant jusqu’au ras de la résine. ▸ Déposer 400 µL et ouvrir le robinet pour faire pénétrer l’échantillon dans la résine. ▸ Éluer en continu à l’aide de la solution de NaCl  Élution du mélange 1 : ▸ Commencer l’élution en récupérant l’éluat dans une éprouvette graduée. ▸ Dès que le bleu dextran commence à sortir, récupérer l’éluant dans les tubes jaugés pour pouvoir déterminer les volumes d’élutions. ▸ Récupérer l’éluat dans les tubes jusqu’à ce que la vitamine B12 soit sortie ▸ Déterminer V0 et Vtotal  Élution des marqueurs de masse molaire : ▸ Récupérer l’éluat dans une éprouvette graduée jusqu’à un volume d’élution Ve = V0 1 mL. ▸ Récupérer ensuite l’éluat dans les tubes jaugés jusqu’à Ve = Vtotal +1 mL. ▸ Révéler ensuite la présence de protéines à l’aide du réactif de Bradford.  Élution du lysozyme : procéder de la même façon que pour les marqueurs de masse molaire. Chromatographie – Révélation 

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Pour chaque tube : ▸ Prélever 100 µL dans un tube à hémolyse. ▸ Ajouter 2 mL de réactif de Bradford. ▸ Vortexer pour bien mélanger le contenu du tube. Attendre 5 minutes. Lire les absorbances des tubes à 595 nm et noter le(s) volume(s) d’élution correspondant au(x) tube(s) d’absorbance maximum. FIN...