VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE PARA CUANTIFICAR SALICILATO DE SODIO EN ORINA PDF

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PRÁCTICA 5VALIDACIÓN DEUN MÉTODOANALÍTICO PORESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE PARA CUANTIFICAR SALICILATO DE SODIO EN ORINAINSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICASDEPARTAMENTO DE FARMACIAACADEMIA DE BIOFARMACIALISTA DE COTEJORubro % cumple1.- Registro de datos completos 102.-T...

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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE FARMACIA

PRÁCTICA 5

ACADEMIA DE BIOFARMACIA

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE PARA CUANTIFICAR SALICILATO DE SODIO EN ORINA

LISTA DE COTEJO Rubro

%

1.- Registro de datos completos

10

2.-Tablas llenas

30

3.- Gráficas

15

4.- Cálculos matemáticos

15

5.- Criterios

10

6.- conclusión

10

7.- Cuestionario

10

cumple

Calificación Diagrama de flujo 3+3+3+3+3

15

Diagrama causa - efecto 3+3+3+3+3+3+3+3+3+3

30

Profesor

1

PRÁCTICA

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

5

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR

DEPARTAMENTO DE FARMACIA ACADEMIA DE BIOFARMACIA

ESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE PARA CUANTIFICAR SALICILATO DE SODIO EN ORINA I. INTRODUCCIÓN Para llevar a cabo estudios farmacocinéticos, de biodisponibilidad y de bioequivalencia, es necesario contar con métodos analíticos sensibles que permitan cuantificar las concentraciones del fármaco en el fluido biológico de interés (plasma, suero, sangre total, orina, etc.). Actualmente existen diversas técnicas analíticas usadas para tal fin como: la cromatografía de líquidos de alta resolución, la cromatografía de gases, métodos espectrofotométricos y microbiológicos, el radioinmunoanálisis, entre otros. Independientemente de la técnica empleada, para que los métodos puedan ser empleados para la determinación de los fármacos estos deben de estar validados. El principal objetivo de la validación de los métodos bioanalíticos es demostrar la fiabilidad de un método particular para la determinación de la concentración del analito en una matriz biológica específica, tales como sangre, plasma, orina, saliva o tejido. El protocolo de validación debe estar documentado. Los parámetros principales de la validación de un método bioanalítico son: selectividad, efecto de matriz, efecto de acarreo, límite inferior de cuantificación (el 5% del Cmáx reportado para el analito de interés), linealidad, exactitud, precisión (repetibilidad y reproducibilidad) y estabilidad de la muestra (condiciones de almacenamiento, a corto y largo plazo, ciclos de congelación-descongelación, etc.), estabilidad en solución. Dichos parámetros deben ser presentados en un informe, el cual deberá incluir la documentación completa del protocolo, la realización y evaluación de los análisis de acuerdo con los principios de buenas prácticas de laboratorio (BPL), los criterios y el cumplimiento de las directrices de la NOM-177-SSA1-2013 de forma resumida:       

Informe de validación en un formato de tabla El método de análisis aplicado Procedimiento de ensayo Estándares de referencias (origen, lote, certificado de análisis, estabilidad) Tablas de los resultados de los parámetros evaluados con la fecha del análisis Desviaciones de los resultados obtenidos con la justificación de las medidas tomadas Conclusión

ll. OBJETIVO Validar un método bioanalítico para cuantificar salicilato de sodio en orina por un método espectrofotométrico.

2

Ill. MATERIAL

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Parámetro

DEPARTAMENTO DE FARMACIA ACADEMIA DE BIOFARMACIA

Material Tubos de ensayo Pipetas graduadas

Selectividad

Capacidad (mL) 10

Cantidad

5

2

1

12

250 10

12 1 16

50

17

1

1

1 2

2

12

Pipetas volumétricas

Embudo de vidrio Matraces volumétricos Matraces erlenmeyer

Pipetas graduadas

Linealidad del método 1

3 Pipetas volumétricas

1

4 1

Pipeta graduada Repetibilidad

Matraces volumétricos Tubos de ensayo Pipeta graduada Pipetas volumétricas

5 5 250 10 10 5 1 2

1 1 1 30 30 1 1 1

3

Parámetro

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE FARMACIA ACADEMIA DE BIOFARMACIA

Material

Capacidad (mL) 3

Cantidad

1

4

1

5

1

250 1 Matraces volumétricos 10 20

Reproducibilidad (por equipo)

Tubos de ensayo 10

20

5

1

Pipetas graduadas

1 Pipetas volumétricas

Estabilidad

2 3 5

1 1 1 1

Primera sesión

4

Parámetro

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Material

Capacidad (mL) 100

Cantidad

1

Matraces volumétricos 10

6

10

7

5

1

1 Pipetas volumétricas 2 3 Tubos de plásticos con tapón 10 Segunda y tercera sesión Pipeta graduada 5 Pipetas volumétricas 1 Tubos de ensayo 10

1 1 1 6

Tubos de ensayo (refrigeración y ciclos de Pipeta graduada congelación – descongelación)

Reactivos

Equipo

 Estándar de salicilato de sodio.  Solución cloruro férrico (10 mg/mL).  Agua destilada

 Balanza analítica  Espectrofotómetro visible

1 7 7

Cronograma de actividades

Prueba Linealidad del método Selectividad Repetibilidad Reproducibilidad Condiciones de almacenamiento Ciclos de refrigeración Ciclos de congelación - descongelación Mezcla de orina Preparar Cloruro férrico 1% Explicar práctica 6

Día 1 2y4 2 5 1y3

Equipos designados Día 2 Día 3 2y5 4y6

1y3

6

6

6

6

6 4 cantidad: 1L

4 4 cantidad: 0.5 L

1y3

6 5 5 cantidad: 0.5 L 2

5

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Descripción del estándar de referencia

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Nombre Tipo Lote Pureza Proveedor

Salicilato de sodio Estándar secundario 99% Sigma

DIAGRAMA DE FLUJO

Selectividad

Filtrar 5mL de muestras

Transferir 1 mL muestra filtrada 5mL FeCl3 y agitar

6

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE FARMACIA ACADEMIA Medir absorbancia 540 DE BIOFARMACIA nm

Calcular % respuesta respecto a LIC

Indicar cumplimientos de la NOM-177

FIN

Linealidad

500 mg SS+250 mL Orina en matraz vol. 250 mL

Por triplicado: 0.5, 1,2,3,4 y 5 mL a matraz vol. 10 mL y aforar con orina

1 mL sol. mas 5 mL FeCl3 y agitar

7

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE FARMACIA ACADEMIA Ajuntar blanco 1mL primaDE BIOFARMACIA + 5mL FeCl3

Determinar absorbancia anotar y graficar abs vs [ ] nominal

Linealizar y obtener [ ] recuperada

Graficar[ ]recuperada vs[ ] nominal

FIN

Calcular R, R*2 y % desviacion

Reportar cumplimient de la NOM-177

ESCUELA NACIONA NACIONAL L DE CIENCIAS BIOLOGICAS I.P.N

DEP DEPART ART ARTAMENTO AMENTO DE F FARMACIA ARMACIA

Medio ambiente

NOMBRE DEL ALUMNO:Espinoza

GRUPO: 8FV1

Mano de obra

Aforar incorrectament

Medicion DIAGRAMA CAUSA-EFECTO

EQUIPO: 1

Humedad

Aguilar Diana Angelica

SECCION BIOFARMACIA

TEMA VALIDACION DE UN METODO ANALITICO POR

CALIFICACION

ESPECTOFOTOMETRIA VISIBLE PARA CUANTIFICAR SALICILATO DE SODIO EN ORINA

muestra

Agitar uno mas que otro

Luz

Personal no calificado

Temperatura

Curva de calibracion

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Balanza no calificada

Impurezas en filtro Refrigerador no calificado

Húmedo e inadecuado

contaminados

Materiales

No cumple con criterios de exactitud, selectividad estabilidad y congelación.

Método de trinder incorrecto

Espectofotomet ro no calibrado

Maquinaria

Metodo

IV.DESARROLLO Selectividad Demostrar la no interferencia de compuestos endógenos de la matriz biológica, mediante la evaluación individual de al menos 6 unidades de ésta. 1. Antes de mezclar la orina que cada equipo proporcionó, filtrar 5 mL de cada una de las muestras en un vaso de precipitado. 2. Transferir 1 mL de cada orina filtrada a tubos de ensaye de vidrio, agregar 5 mL de la solución de cloruro férrico y agitar. 3. Determinar las absorbancias de todas las muestras anteriores a una longitud de onda de 540 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con mezcla de orina en la tabla 1. 4. Calcular el porciento de respuesta comparando los resultados con el límite de cuantificación (punto bajo de la linealidad del método). 5. Indicar si los resultados cumplen con los criterios de aceptación de la NOM-177 vigente. Tabla 1. Selectividad Equipo 1 2

Absorbancia

Porcentaje de respuesta 0.123 68.1063123 0.109 60.3543743

3

0.116 64.2303433

4

0.125 69.213732

5 6

0.102 56.4784053 0.103 57.0321152 9

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0.102 56.4784053 Mezcla

0.098 54.2635659 Absorbancia Límite de cuantificación (linealidad del método) Promedio

0.186 0.177 0.179

0.18066667

Criterio NOM-177:La respuesta analítica de las interferencias próximas al tiempo de retención debe ser menor al 20% para el limite inferior de cuantificación del analito y del 5% para el EI. Conclusión: Se concluyo que el método no es selectivo ya que las interferencias endógenas tuvieron respuestas analíticas superiores al 20% con respecto al limite de cuantificación.

Curva de calibración (Linealidad del método) Caracterizar por lo menos seis concentraciones distintas, se debe de definir un modelo matemático que describa adecuadamente la relación entre la concentración y la respuesta. Se evaluara un mínimo de 3 curvas de calibración y se calculara los resultados de la concentración recuperada y el por ciento de desviación. 1. Pesar 500 mg de salicilato de sodio, transferir cuantitativamente a un matraz volumétrico de 250 mL, disolver con orina y llevar al aforo con el mismo diluente. 2. Transferir por triplicado alícuotas de 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5 mL a matraces volumétricos de 10 mL respectivamente y aforar con orina. 3. Transferir 1 mL de cada solución a tubos de ensayo, agregar 5 mL de la solución de cloruro férrico y agitar. 10

4. Preparación del blanco: En un tubo de ensayo colocar mL de orina, agregar 5 mL de la solución de cloruro férrico y agitar.

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5. Determinar las absorbancias de todas las soluciones anteriores a una longitud de onda de 540 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco. Anotar los datos en la tabla 2 y graficar los datos de la absorbancia vs concentración nominal (grafica 1). 6. Aplicar la regresión lineal de los datos para obtener la ecuación de la recta y posteriormente la concentración recuperada, anotar los resultados en la tabla 3, graficar la concentración recuperada contra concentración nominal (grafica 2). Calcular el coeficiente de correlación (r), Coeficiente de determinación (r2), el coeficiente de variación y la desviación relativa de cada nivel. 7. Consultar la NOM-177 e indicar si se cumple con los criterios de la norma.

Tabla 2. Curvas de Calibración (absorbancia vs concentración nominal) Fecha:_Dia 1______ Réplica

1 2 3 Ecuación r r2

Fecha:_Dia 2_____ Réplica

1 2 3 Ecuación r r2 Fecha:_Dia 3_____ Réplica

Concentración nominal (µg/mL)

100 0.186 0.177 0.179

200 0.352 0.354 0.349

400 600 0.671 0.996 0.657 0.991 0.681 0.997 y=0.0016x +0.0172 0.9992 0.9996

800 1.318 1.312 1.308

1000 1.67 1.667 1.662

Concentración nominal (µg/mL)

100 0.182 0.182 0.193

200 0.355 0.365 0.36

100

200

400 600 0.71 0.996 0.712 0.991 0.711 0.997 y=0.0344 + 0.0016x 0.9980 0.999

800 1.318 1.312 1.308

1000 1.67 1.667 1.662

Concentración nominal (µg/mL)

400

600

800

1000 11

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2 3 Ecuación r r2

Fecha:_Dia 4_______ Réplica

1 2 3 Ecuación r r2

0.186 0.178 0.179

0.352 0.326 0.349

0.671 0.668 0.681

0.994 0.991 0.997

1.318 1.312 1.308

1.67 1.668 1.66

y=0.0143 + 0.0016x 0.9992 0.9996

Concentración nominal (µg/mL)

100

200 0.17 0.17 0.172

400 600 0.326 0.488 0.326 0.484 0.32 0.483 y= 0.0011 + 0.0008x 0.9984 0.9992

800 0.666 0.642 0.65

1000 0.829 0.819 0.834

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Gráfica 1. Linealidad del método (absorbancia vs concentración nominal) Resultados

Fecha:________________

Ecuación: r2

y= 0.0016x + 0.0172 0.9996

Tabla 3. Linealidad del método (concentración recuperada vs concentración nominal) Concentración recuperada (µg/mL) 100 200 400 600 800 1000 1 105.5 209.25 408.625 611.75 813 1033 2 99.875 210.5 399.875 608.625 809.25 1031.125 3 101.125 207.375 414.875 612.375 806.75 1028 102.166666 209.041666 407.791666 610.916666 809.666666 1030.70833 Promedio 7 7 7 7 7 3 2.95363476 1.57288217 7.53464221 2.00909390 3.14576434 2.52590742 D. E. 6 4 7 9 8 8 2.89099650 0.75242519 1.84766949 0.38852585 0.24506519 0.32886546 C. V. % 9 8 2 6 9 Desviació n Relativa 2.16666667 4.52083333 1.94791667 1.81944444 1.20833333 3.07083333 % Criterio NOM-177: Los datos de concentración recuperada de la curva de calibración deben estar dentro 15% de la concentración nominal en cada nivel de concentración, excepto para el limite de cuantificación ya que puede ser menor o igual que el 20% Conclusión: Se concluyo que cumple con el criterio de linealidad ya que todos los puntos de concentración ya que tiene una desviación relativa % menor al 15% y menor 20% para el limite de cuantificación 100 microgramos/ mL Replica

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Gráfica 2. Linealidad del método (concentración recuperada vs concentración nominal). Fecha:________________

Ecuación: r2

Resultados y= 1.0227x- 0.0188 0.9996

Exactitud del método La exactitud se determinará calculando la desviación relativa. Para ello se tomarán los valores promedio de la concentración recuperada de cada nivel de concentración (tanto de los datos de Repetibilidad como de los de Reproducibilidad) y se restará del valor real (concentración adicionada). La desviación relativa se calculará mediante la siguiente fórmula:

%Desv.Rel=

( concentración adicionada− concentraciónrecuperada ) × 100 concentración adicionada

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Precisión Para evaluar la precisión del método, se determinará tanto la repetibilidad (precisión entre días) como la reproducibilidad intralaboratorio (precisión interdías con diferentes analistas). Para ello se analizarán concentraciones conocidas de salicilato de sodio en orina, tres de ellas son diferentes a los de la curva de calibración, pero incluidas dentro del rango lineal, en un nivel bajo, medio y alto, así como el límite de cuantificación, finalmente dos concentraciones diluidas (1:2, 1:4). La precisión del método se establecerá mediante el cálculo del coeficiente de variación de las concentraciones recuperadas. a) Repetibilidad. Analizar en un mismo día por quintuplicado, un mínimo de tres concentraciones conocidas: baja, media y alta de salicilato de sodio en orina. 1. Pesar 500 mg de salicilato de sodio, transferir cuantitativamente a un matraz volumétrico de 250 mL, disolver con orina y aforar con el mismo diluente. 2. Transferir por quintuplicado 0.5, 1.5, 2.5 y 3.5 mL a matraces volumétiricos de 10 mL respectivamente y aforar con orina. 3. Transferir 1 mL de cada solución preparada anteriormente a tubos de ensayo, agregar 5 mL de la solución de cloruro férrico y Agitar. Repetibilidad muestra diluida: 4. Transferir por quintuplicado 7 mL de la solución con concentración de 2 mg/mL de salicilato de sodio preparada en el punto 1 a matraces aforados de 10 mL respectivamente y aforar con orina, realizar las diluciones 1:2 y 1:4 de cada replica con orina. 5. Transferir 1 mL de cada solución preparada anteriormente a tubos de ensayo, agregar 5 mL de la solución de cloruro férrico y Agitar. 6. Determinar las absorbancias de todas las soluciones anteriores a una longitud de onda de 540 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco. 7. Anotar los datos en la tabla 4. 8. Obtener la concentración recuperada interpolando las absorbancias en la ecuación obtenida en la linealidad del método. Calcular el coeficiente de variación y la desviación relativa. 9. Indicar el criterio de aceptación y si este se cumple según la NOM-177. b) Reproducibilidad intralaboratorio: Analizar por quintuplicado durante tres días 2 analistas diferentes, un mínimo de tres concentraciones conocidas: baja, media y alta de salicilato de sodio en orina, así como el límite de cuantificación. Primer día 1. Pesar 500 mg de salicilato de sodio, transferir cuantitativamente a un matraz volumétrico de 250 mL, disolver con orina y aforar con el mismo diluente. 15

2.

Transferir por

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quintuplicado 0.5, 1.5, 2.5 y 3.5 mL de la solución anterior a matraces aforados de 10 mL respectivamente y aforar con orina.

3. Transferir 1 mL de cada solución del punto anterior a tubos de ensayo, agregar 5 mL de la solución de cloruro férrico y Agitar. 4. Determinar las absorbancias de todas las soluciones anteriores a una longitud de onda de 540 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco. 5. Anotar los resultados en la tabla 5. 6. Obtener la concentración recuperada interpolando las absorbancias en la ecuación obtenida de la curva de calibración del día correspondiente. Calcular el coeficiente de variació...