09. Addizione nucleofila con eliminazione PDF

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9 9.1: I derivati degli acidi carbossilici I gruppi funzionali oggetto di questo capitolo sono quelli dei derivati degli acidi carbossilici, che comprendono gli acidi carbossilici stessi, i carbossilati (anioni di acidi carbossilici), esteri, ammidi, tioesteri, e acilfosfati.

Gli esteri ciclici e le ammidi cicliche sono chiamati, rispettivamente, lattoni e lattami.

Le anidridi e i cloruri degli acidi carbossilici, che fanno parte della classe dei derivati degli acidi carbossilici, non sono presenti fra le biomolecole, ma sono intermedi utili nella sintesi di laboratorio. Essi vengono trattati in un paragrafo sulle reazioni di laboratorio alla fine di questo capitolo.

I derivati degli acidi carbossilici si differenziano dalle aldeidi e dai chetoni per la presenza di un eteroatomo elettronegativo - in genere ossigeno, azoto o zolfo - legato direttamente al carbonio carbonilico. Si può considerare un derivato di un acido carbossilico come se fosse composto di due parti. Una parte è il gruppo acilico, ossia il gruppo carbonilico legato a un gruppo alchilico o

2 arilico (R o Ar). Nei casi particolari in cui R sia idrogeno o metile, i nomi comuni usati sono, rispettivamente, gruppo formile e gruppo acetile. L'altra parte è costituita dal gruppo legato attraverso l'eteroatomo e a volte verrà indicato come X-R.

Si noti che i gruppi X-R legati al gruppo acilico sono semplicemente forme deprotonate di altri gruppi funzionali: per una ammide, per esempio, HX-R è un'ammina, mentre per un estere HX-R è un alcol.

Le molecole di 'acido grasso' come lo stearato sono invece carbossilati con lunghe catene di carbonio legate al gruppo acilico.

Gli aromi di molti frutti provengono da piccole molecole che contengono la funzione estere:

I 'legami peptidici' che legano gli amminoacidi nelle proteine sono ammidi:

3 L'acetil-coenzima A, una molecola che è una unità strutturale a due atomi di carbonio (gruppo acetile) molto importante nel metabolismo, è caratterizzato dalle reazioni del suo gruppo funzionale tioestere:

9.2: Il meccanismo della sostituzione nucleofila acilica Il fatto che uno degli atomi adiacenti al carbonio carbonilico nei derivati degli acidi carbossilici sia un eteroatomo elettronegativo - e non un carbonio, come avviene nei chetoni, o un idrogeno, come avviene nelle aldeidi - è fondamentale per comprendere la reattività dei derivati degli acidi carbossilici. La differenza più significativa tra un chetone/aldeide e un derivato di un acido carbossilico è che quest'ultimo, a differenza dai chetoni e dalle aldeidi, ha un potenziale gruppo uscente legato al carbonio carbonilico (quello che noi chiamiamo gruppo X-R).

In conseguenza di ciò, mentre con i chetoni e le aldeidi la reazione è limitata all'addizione, seguita da un trasferimento di protone, i derivati degli acidi carbossilici subiscono una reazione di addizione nucleofila che però è seguita da eliminazione (o sostituzione intramolecolare) del gruppo X-R. Una reazione su un derivato acilico inizia con un attacco nucleofilo al carbonile, che porta ad un intermedio tetraedrico (passaggio 1). Nel passaggio 2 si forma di nuovo il carbonile e il gruppo X-R viene espulso, in genere ricevendo un protone da un acido, e il risultato finale è una formale sostituzione del gruppo X-R con il nucleofilo.

4 Meccanismo di una addizione nucleofila seguita da eliminazione:

Si noti che nel prodotto il nucleofilo diventa il nuovo gruppo X-Z. Ecco perché questo tipo di reazione è chiamato a volte sostituzione nucleofila acilica: un gruppo acile X è sostituito con un altro gruppo (nucleofilo). Ad esempio, nella reazione che segue, un alcol 'gruppo X' (metanolo), prende il posto di un altro alcool 'gruppo X' (3-metil-1-butanolo) in quanto un estere viene trasformato in un altro estere.

Un altro modo di considerare questa reazione è descrivere il trasferimento di gruppo acile dal gruppo X a un altro: nell’esempio precedente, il gruppo acetile (verde), viene trasferito dal 3-metil1-butanolo (blu) al metanolo (rosso). Per questo motivo, le sostituzioni nucleofile aciliche vengono definite di solito reazioni di trasferimento di gruppi acilici. Gli enzimi che catalizzano le reazioni di sostituzione acilica nucleofila si sono evoluti perfezionando la stabilizzazione dell'intermedio tetraedrico con carica negativa, e in tal modo riducono l'energia di attivazione del primo passaggio che determina la velocità del processo (attacco nucleofilo). Lo stato di transizione del primo passaggio assomiglia all’intermedio tetraedrico che si forma: ricordiamo dal capitolo 6 che il postulato di Hammond ci dice che tutto ciò che stabilizza l'intermedio tetraedrico stabilizza anche lo stato di transizione. In molti casi, ad esempio, i residui degli amminoacidi presenti nell'enzima sono disposti nel sito attivo in modo da fornire legami idrogeno stabilizzanti attraverso interazioni con l'ossigeno che ha carica negativa. La figura qui sotto mostra un intermedio tetraedrico stabilizzato da legami idrogeno (donatori) provenienti da due atomi di azoto ammidici della catena peptidica dell'enzima.

5 9.3: La reattività relativa dei derivati degli acidi carbossilici Nei derivati degli acidi carbossilici, attraverso la mesomeria la carica positiva parziale sul carbonio carbonilico è stabilizzata per donazione di elettroni di non legame dall'eteroatomo adiacente, con conseguente diminuzione di elettrofilicità.

Tra i derivati degli acidi carbossilici, i gruppi carbossilato sono meno reattivi nei confronti della sostituzione nucleofila acilica, seguiti dalle ammidi, poi dagli esteri carbossilici e dagli acidi carbossilici, dai tioesteri, e infine dagli acil fosfati, che sono i più reattivi tra i gruppi acilici biologicamente significativi. Le anidridi degli acidi e i cloruri degli acidi sono reagenti di laboratorio analoghi ai tioesteri e agli acil fosfati, nel senso che anch'essi sono derivati altamente reattivi degli acidi carbossilici. Il paragrafo 9.8 verso la fine di questo capitolo contiene informazioni sulla chimica di questi due tipi di reagenti.

Reattività relativa dei derivati degli acidi carbossilici:

6 La scala di reattività dei derivati degli acidi carbossilici può essere compresa valutando la basicità del gruppo uscente (gruppo X-Z) e ricordando, dal paragrafo 8.4, che le basi deboli sono i gruppi uscenti migliori. Un tioestere è più reattivo un estere, ad esempio, perché un tiolato (RS-) è una base debole e migliore gruppo uscente rispetto a un alcossido (RO-). Ricordiamo che il pKa di un tiolo è di circa 10, mentre il pKa di un alcool è 15 o superiore: se un acido è forte, la sua base coniugata è debole. In genere, il nucleofilo che entra, se è una base più debole rispetto al gruppo 'X-Z' che è già presente, sarà anche gruppo uscente migliore, e quindi il primo passaggio dell'addizione nucleofila semplicemente si inverte e l'unico prodotto recuperato sarà il materiale di partenza:

In generale, in queste reazioni di addizione/eliminazione i derivati degli acidi carbossilici che hanno energia più elevata si trasformano in derivati con energia più bassa. Ad esempio, nelle reazioni biochimiche i tioesteri sono spesso trasformati direttamente in esteri carbossilici, ma non avviene il contrario. Per superare un passaggio sfavorito (da carbossilato a tioestere, ad esempio) è necessario accoppiare la reazione sfavorita con una reazione favorita dal punto di vista energetico. Vedremo nel prossimo paragrafo come questo avviene.

9.4: Gli acil fosfati Gli acil fosfati vengono considerati generalmente intermedi di reazione, piuttosto che metaboliti stabili nei passaggi biochimici perché sono molto reattivi e subiscono facilmente l’attacco di nucleofili. Essi di solito si presentano in due forme: o come semplici monofosfati acilici, o come acil-adenosina monofosfati (acil AMP).

7 Entrambe le forme sono altamente reattive in reazioni di addizione/eliminazione, ed essi sono spesso chiamati 'gruppi acilici attivati' o 'acidi carbossilici attivati' per ragioni che diverranno presto chiare. La tendenza dei fosfati a formare complessi stabilizzati con uno o più ioni magnesio nel sito attivo di un enzima contribuisce notevolmente alla reattività dei fosfati acilici.

Uno ione magnesio si comporta come un acido di Lewis, richiamando densità elettronica dall'ossigeno del gruppo carbonilico acilico, e quindi aumenta notevolmente l'elettrofilicità del carbonio carbonilico. Lo ione magnesio si coordina anche con la carica negativa sul fosfato, rendendolo base debole ed eccellente gruppo uscente. Abbiamo già imparato che il gruppo funzionale carbossilato è il substrato meno reattivo per reazioni di addizione/eliminazione catalizzate da enzimi. In biologia, però, i carbossilati sono spesso trasformati in tioesteri, esteri carbossilici, e ammidi, tutti a energia più elevata, e ciò significa che queste trasformazioni sono termodinamicamente sfavorite.

In che modo procedono queste sostituzioni sfavorite? Esse non vengono effettuate direttamente: come tutte le reazioni termodinamicamente sfavorite, in biochimica, ma sono collegate con una reazione favorita che rilascia energia. In questo caso, (e in molti altri), la reazione collegata che

8 permette la reazione sfavorita è l'idrolisi dell'ATP. Per poter subire una reazione di sostituzione acilica, un carbossilato deve prima essere attivato per fosforilazione. Avete già visto questo processo di trasferimento del gruppo fosforile nel capitolo 9. In molti casi gli enzimi attivano un gruppo carbossilato trasformandolo in un acil fosfato (il più reattivo dei derivati degli acidi carbossilici) grazie a una molecola di ATP: il meccanismo di questo tipo di trasformazione è riportato nel paragrafo 7.5.

Formazione di un acil fosfato (vedere il paragrafo 7.5 per il meccanismo completo):

Come alternativa abbastanza frequente, alcune reazioni enzimatiche iniziano con la trasformazione di uno ione carbossilato in un intermedio acil-AMP.

Formazione di un acil-AMP (vedere il paragrafo 9.5 per il meccanismo completo):

In entrambi i casi, una volta che il gruppo carbossilato è stato attivato, e gli intermedi reattivi acil fosfato o acil-AMP possono andare a reagire come elettrofili in una reazione di sostituzione nucleofila acilica energeticamente favorevole.

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Probabilmente avete sentito parlare dell'ATP come di una molecola che serve per accumulare energia. Le reazioni in questo paragrafo forniscono un esempio più concreto di questo concetto. Un gruppo a bassa energia (un anione carbossilato) viene trasformato in un gruppo ad alta energia (un tioestere, per esempio) a spese di un ATP ad alta energia.

9.5: Formazione di tioesteri, esteri carbossilici, e ammidi 9.5A: Formazione di tioesteri I tioesteri, che sono di per sé piuttosto reattivi nelle reazioni di sostituzione acilica (ma meno degli acilfosfati), svolgono un ruolo fondamentale nel metabolismo degli acidi grassi. Il gruppo Z-X in un tioestere è un tiolo. Il Coenzima A è un coenzima che contiene la funzione tiolo e svolge un ruolo chiave nel metabolismo. Il Coenzima A è spesso abbreviato ‘CoASH’, al fine di sottolineare l’importanza della funzionalità tiolo.

Il Coenzima A opera come gruppo trasportatore nella biosintesi dei lipidi, ed è legato con un legame tioestere alle catene degli acidi grassi che vengono allungate. Il palmitil-SCoA, che viene riportato qui, è un esempio di un tipico tioestere acil-SCoA.

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Se consideriamo le reazioni che coinvolgono i tioesteri di questo e dei paragrafi che seguono, vedremo che il Coenzima A svolge un ruolo chiave. Studieremo anche la formazione e la rottura dei legami tioestere tra un gruppo acilico e altre specie contenenti la funzione tiolo, ad esempio un residuo di cisteina presente nella catena di un enzima a livello di sito attivo:

Il termine 'tioesterificazione' si riferisce alla formazione di un gruppo funzionale tioestere. In una tipica reazione biochimica di tioesterificazione, un gruppo carbossilato viene prima trasformato in un acilfosfato (in altre parole, viene attivato), e poi l'acil fosfato subisce una reazione di sostituzione al gruppo acilico da parte di un tiolo nucleofilo.

La reazione di tioesterificazione

Meccanismo: Passaggio di attivazione:

11 Passaggi di addizione/eliminazione

Gli acidi grassi, come il palmitato, che derivano dai grassi e dagli oli presenti nei cibi, vengono trasformati in tioesteri acil coenzima A, prima di essere scissi nella via di degradazione degli acidi grassi.

Una transtioesterificazione è la trasformazione di un tioestere in un altro, o, in altre parole, il trasferimento di un gruppo acilico da un tiolo a un altro.

Transtioesterificazione Gli acidi grassi, come il palmitato, che derivano dai grassi e oli presenti nei cibi, vengono trasformati in acil coenzima A tioesteri prima di entrare nella via di degradazione degli acidi grassi.

12 Meccanismo:

Ad esempio, quando un organismo sintetizza acidi grassi, l'unità acido grasso a due atomi di carbonio, l'acetil-CoA, viene dapprima trasformata in acetil-SACP (EC 2.3.1.38). ACP è un'abbreviazione per 'Acyl Carrier Protein', e indica una proteina che presenta un gruppo tiolo libero legato attraverso un distanziatore a una serina in una delle sue catene laterali. Durante tutto il processo di allungamento della catena dell’acido grasso, la catena dell’acido che si allunga resta legata all'ACP.

9.5B: Formazione di esteri Il termine esterificazione si riferisce alla formazione di un nuovo gruppo funzionale estereo. In una tipica esterificazione biochimica, un tioestere subisce un attacco nucleofilo da parte di un alcool e si formano un estere e un tiolo.

Reazione di esterificazione (da un tioestere)

13 Meccanismo:

Passaggio 1 (transtioesterificazione): La reazione che segue fa parte della sintesi del triacilglicerolo, la forma in cui i grassi vengono accumulati nel nostro organismo.

Passaggio 2 (esterificazione):

La reazione, catalizzata da monoacilglicerolo aciltransferasi (EC 2.3.1.22), comincia (sopra, passaggio 1) con un passaggio preliminare di transtioesterificazione, in cui il gruppo dell’acido grasso è trasferito dal coenzima A ad un residuo di cisteina presente nel sito attivo dell’enzima. Ricordiamo che, secondo una strategia comune a tutti gli enzimi, si forma innanzi tutto un legame covalente con un substrato, prima di catalizzare la reazione chimica 'principale', e questo serve a ridurre il fattore entropico. Nella passaggio 2 della reazione il gruppo dell’acido grasso è ora pronto per essere trasferito al glicerolo, per cui si scinde il legame tioestere con la cisteina e si forma un nuovo legame estereo con uno dei gruppi alcolici del glicerolo. La scoperta della penicillina è stata senza dubbio uno degli eventi più importanti nella storia della

14 medicina moderna. Il gruppo funzionale fondamentale penicillina è il β-lattame a quattro termini (ricordiamo che un lattame è un ammide ciclica).

La penicillina, con le generazioni successive di farmaci antibiotici, ha salvato innumerevoli vite da infezioni batteriche che una volta erano mortali. La conoscenza del meccanismo di azione chimica della penicillina è stata anche una pietra miliare per comprendere come i farmaci funzionano a livello molecolare. Adesso sappiamo che la penicillina, e alcuni farmaci ad essa strettamente collegati, come l'ampicillina e l'amoxicillina, agiscono inibendo un enzima che è coinvolto nella costruzione della componente peptidica delle pareti delle cellule batteriche. I dettagli della reazione di costruzione delle pareti non rientrano nell'ambito di questa trattazione, ma è sufficiente sapere che il processo comporta la partecipazione di un residuo di serina nucleofilo presente nel sito attivo dell’enzima. La molecola di penicillina è in grado di entrare nel sito attivo, e una volta entrata, il carbonile del lattame serve come 'esca' elettrofila per l’ossidrile nucleofilo della serina:

Anche se ci si potrebbe aspettare che una trasformazione da ammide ad estere come quella riportata

15 sopra fosse energeticamente sfavorevole, in base alla scala delle reattività che abbiamo riportato, questo lattame è molto più reattivo di un gruppo ammidico ordinario per effetto della tensione di anello: ricordiamo dal paragrafo 3.2 che gli anelli a quattro termini sono altamente tensionati, e una notevole energia viene rilasciata quando vengono aperti. La tensione di anello spiega anche perché la penicillina tende a degradarsi: infatti a contatto con l'acqua nel tempo il lattame dà spontaneamente idrolisi, con apertura dell'anello e formazione di un gruppo carbossilato. Purtroppo molti ceppi di batteri hanno acquisito un enzima chiamato penicillasi (EC 3.5.2.6), che catalizza la rapida idrolisi dell’anello lattamico nei farmaci a base di penicillina, rendendoli inattivi. Questi batteri sono quindi resistenti alla penicillina e agli antibiotici ad essa correlati. Come probabilmente sapete, l'evoluzione della resistenza ai farmaci nei batteri è un importante problema per la salute in tutto il mondo, e gli scienziati sono impegnati in una lotta continua per sviluppare nuovi antibiotici man mano che quelli più vecchi diventano sempre meno efficaci. In una reazione di transesterificazione, un estere viene trasformato in un altro attraverso una sequenza addizione/eliminazione.

Meccanismo di una reazione di transesterificazione:

Se lo studio della chimica organica a volte provoca mal di testa, è possibile ricorrere per un aiuto a una reazione di transesterificazione. Le prostaglandine sono una famiglia di molecole che promuovono un grande numero di processi biologici, tra cui l’infiammazione. L'acido acetilsalicilico, comunemente noto con il nome di aspirina, agisce trasferendo - attraverso una reazione di transesterificazione - un gruppo acetile ad un residuo di serina sull'enzima responsabile della biosintesi della prostaglandina H2 (PGH2, un componente della famiglia delle prostaglandine).

16 L'acetilazione di questa serina blocca un canale che conduce al sito attivo dell'enzima e impedisce la produzione di prostaglandine, con il risultato di inibire il processo di infiammazione che provoca il mal di testa. Nel paragrafo 9.8 vedremo due reazioni di addizione/eliminazione da condurre in laboratorio che portano alla formazione, rispettivamente, di aspirina e ibuprofen. 9.5C: La formazione delle ammidi Un gruppo carbossilato attivato (in altre parole, un acil fosfato o un acil-AMP) può essere trasformato in una ammide tramite attacco nucleofilo da parte di NH3 o di una ammina.

Meccanismo per la formazione di una ammide:

In biologia i passaggi della biosintesi degli aminoacidi forniscono esempi di formazione di ammidi. L'amminoacido glutammina è sintetizzato nella maggior parte delle specie trasformando la catena laterale dell'acido glutammico (un altro aminoacido) contenente il gruppo funzionale carbossilato in una ammide, dopo aver prima attivato il carbossilato con una monofosforilazione (EC 6.3.1.2):

17 Un processo simile ha luogo durante la sintesi dell’asparagina a partire dall’aspartato, ma in questo caso il gruppo carbossilato attivato è un gruppo acil-AMP che può essere trasformato in una ammide tramite attacco nucleofilo da parte di una ammina.

Meccanismo della formazione di una ammide:

* Nella reazione di sintesi dell’asparagina, il nucleofilo ammoniaca deriva dall'idrolisi di una molecola di glutammina.

9.6: L'idrolisi di tioesteri, esteri, e ammidi Finora abbiamo studiato la formazione di tioesteri, esteri carbossilici, e ammidi, a partire da gruppi carbossilato. Nelle reazioni di addizione/eliminazione con idrolisi, l'acqua è il nucleofilo che entra e un gruppo carbossilato è il prodotto final...