11 I Bandeggi Cromosomici PDF

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I BANDEGGI CROMOSOMICI Prima dello sviluppo delle tecniche di bandeggio, la colorazione dei cromosomi veniva fatta unicamente con il colorante GIEMSA. Giemsa: il nome deriva dal microbiologo tedesco Gustav Giemsa ed è una soluzione in metanolo di Azzurro A e B, blu di metilene ed eosina. Gli azzurri (basici) colorano i componenti cellulari aventi reazione acida. L’eosina (acida) colora in rosso i componenti aventi reazione basica. Colorazione uniforme del cromosoma 1960: conferenza di Denver. Patau e colleghi mettono a punto una prima classificazione dei cromosomi metafasici umani. 1963: Londra. Sulla base della posizione del centromero e della lunghezza dei bracci cromosomici si giunse a distinguere i cromosomi dell’uomo in 7 gruppi (indicati con le lettere da A a G). Il primo bandeggio venne messo a punto tra il 1969 e il 1970 da Caspersson e collaboratori, e si basava sull’uso di quinacrina e mostarda di quinacrina ottenendo quello che venne definito bandeggio-Q. Questo bandeggio produceva lungo il cromosoma una serie di bande luminose e bande scure secondo un modello costante e riproducibile per ogni cromosoma. Il pattern di bande rispecchiava la non uniformità della cromatina lungo il cromosoma: tratti ricchi in AT alternati a tratti ricchi in GC. Le regioni ricche in AT formano le bande (regioni più luminose o più intensamente colorate). Le regioni ricche in GC formano le interbande (regioni meno luminose o meno colorate). Bande simili generate anche da bandeggi diversi: conferma che il bandeggio rispecchia l’ultra-struttura del cromosoma. La scoperta delle bande cromosomiche ha consentito di 1. identificare in modo sicuro le coppie di cromosomi omologhi; 1970: primo cariotipo umano in bande Q. 1971: Conferenza di Parigi. Nomenclatura per identificare regioni cromosomiche, per descrivere le aberrazioni che modificano struttura e numero dei cromosomi. Riferimenti: centromero e telomeri. 200 bande nel cariotipo umano. Attualmente si riconoscono circa 1000 bande, 850 delle quali utilizzabili (ISCN, 1995). Braccio corto (p = petit): segmento cromosomico compreso tra il centromero e il telomero superiore. Braccio lungo (q):compreso tra centomero e telomero inferiore. Ogni braccio è diviso in Regioni: numerate da 1 in poi a partire dal centromero verso il telomero. Le regioni sono divise in bande, numerate da 1 in poi con lo stesso criterio usato per le regioni. Le bande possono essere divise in sottobande, numerate con lo stesso criterio.

Con 10 si indica la regione del centromero:1971: la banda “p10” (si legge “p” “uno” “zero”) indica l’area centromerica del braccio corto; “q10”indica l’area centromerica del braccio lungo. Esempio: Xq21.1:X q due uno punto uno “1”: cromosoma X “q”: braccio lungo “2”: regione 2 “1”: banda 1 “.1”: sottobanda 1

2. identificare un numero maggiore di anomalie cromosomiche e pertanto di fare diagnosi più precise di alcune sindromi; 3. fare correlazioni evolutive tra cariotipo umano e quello di altri primati; 4. comparare modelli di bandeggio tra gruppi diversi di vertebrati: pesci ossei, anfibi, rettili, uccelli, mammiferi. I diversi tipi di bandeggio possono raggrupparsi in: 1.Bandeggi generali (Q, G e R): individuano bande distribuite lungo il cromosoma e consentono di identificare tutti i cromosomi del cariotipo. 2. Bandeggi particolari (C e NOR): sono limitati a regioni specifiche di singoli cromosomi o di gruppi di cromosomi. 3. Bandeggi sequenziali: lo stesso cromosoma può essere sottoposto a più tipi di bandeggio (es. Q seguito da AgNOR). Solitamente non danno risultati particolarmente soddisfacenti.

BANDEGGIO Q (metodo QFQ: Q-bands by Fluorescence using Quinacrine). •La Quinacrina si lega al DNA mostrando maggiore brillantezza delle sequenze ricche in AT (il fluorocromo si attenua in modo differenziale). •Produce bande brillanti e bande scure che si alternano lungo il cromosoma.

Bande Q-scure (Q-negative) ricche in GC • a replicazione precoce • ricche in geni • ricche in SINE (sequenze Alu)

Bande Q-brillanti (Q-positive) • ricche in AT • a replicazione tardiva • basso contenuto genico • ricche in LINE

VANTAGGI •Metodica semplice che fornisce risultati con una certa facilità. •Utile nell’interpretazione di alcuni eteromorfismi cromosomici. •Riconoscimento immediato del cromosma Y umano la cui eterocromatina appare molto brillante. •Analisi più fine (rispetto al bandeggio G) delle regioni eterocromatiche di alcuni cromosomi (1, 9, 16 Yq, regioni pericentriche dei cromosomi 3 e 4 e dei satelliti degli acrocentrici). SVANTAGGI •Necessità di usare un microscopio a fluorescenza •Rapido decadimento della fluorescenza •Contrasto non troppo elevato APPLICAZIONI 1.Accertamento di paternità. 2.Origine parentale dei cromosomi soprannumerari. 3.Studi evolutivi.

BANDEGGIO G (metodo GTG: G-bands produced with Trypsin and Giemsa) (anche GTW, GTL, GAG): Sumner et al., 1971. 1. Trattamento con Tripsina. 2. Colorazione con Giemsa. 3. Bandeggio sovrapponibile al bandeggio Q. Bande colorate (G-positive) • ricche in AT • a replicazione tardiva • basso contenuto genico • ricche in LINE

Bande chiare (G-negative) ricche in GC • a replicazione precoce • contengono l’80% dei geni • ricche in SINE (sequenze Alu)

Meccanismo ancora non ben compreso: 1.La lisi degli istoni sembra non giocare un ruolo importante: loro modesta perdita con il bandeggio (struttura dei cromomeri praticamente intatta: identica a quella di cromosomi meiotici non trattati). La differente compattazione della cromatina potrebbe influire sulla colorazione per effetto della metacromasia che alcuni componenti del GIEMSA (Azzurro A, Azzurro B, blu di metilene, tionina) possono evidenziare.

2. Regioni AT ricche più condensate, il colorante si lega in forma monomerica (colorazione più intensa): colorazione blu.

3. Regioni GC ricche meno condensate, il colorante si lega in forma polimerica (colorazione meno intensa): colorazione rosa-porpora. VANTAGGI 1. Preparati permanenti. 2. Migliore risoluzione rispetto al bandeggio Q. 3. Meno costoso del bandeggio Q. 4. Non è necessario un microscopio a fluorescenza. SVANTAGGI 1. Risultati ottimali raggiunti solo dopo diversi tentativi:infatti i tempi del trattamento con l’enzima sono molto variabili e poco riproducibili, dipendendo dalla linea cellulare dalla quale sono stati ottenuti i cromosomi (più brevi per linfociti e cellule midollari rispetto ai fibrobalsti). APPLICAZIONI 1.Identificazione dei singoli cromosomi. 2. Studi di citogenetica comparativa tra specie diverse. BANDEGGIO G11 (Giemsa a pH 11; Bobrow M, Madan K, Pearson PL, 1972) 1. E’ una tecnica di colorazione con Giemsa a pH alcalino 2. Colora in moda selettivo alcune regioni eterocromatiche su cromosomi umani (magenta scuro in contrasto con il blu pallido del resto del cromosoma): i cromosomi interessati sono 1, 3, 5, 7, 9, 10, 19 e Y. 3. E’ utile nello studio di eteromorfismi e inversioni pericentriche nell’uomo, specialmente nel cromosoma 9. Il meccanismo d’azione non è ben noto. Sembra colorare in modo più intenso alcune varianti di DNA satelliti umani (satellite III). Il bandeggio G-11 puo essere ottenuto quando le giuste proporzioni di Azzurro B ed Eosina Y sono mescolate, a pH 11. Quando in proporzioni equimolari, la maggior parte di questi coloranti precipitano come grossi cristalli trapezoidali riflettenti. Cristalli più piccoli si hanno nei siti colorati in magenta. Ha il vantaggio di essere un metodo di bandeggio molto rapido, semplice e di facile applicazione.

BANDEGGIO R (metodo RHG e metodo RFA) Introdotto da Dutrillaux e Lejeune (1971). Pretrattamento dei cromosomi in tampone salino a temperature di di 85°C. Questo trattamento è seguito da colorazione con Giemsa (RHG: R Heat Giemsa) o con Arancio di Acridina (RFA: R Fluorescence Acridine). Anche CMA3/Verde Metile sono usati come sostanze fluorescenti. L’elevata temperatura denatura le regioni AT ricche lasciando intatte quelle GC ricche. Le regioni GC ricche si coloreranno intensamente, al contrario di quelle AT ricche (denaturate) Il pattern di bandeggio sarà complementare a quello dei bandeggi G e Q (da qui R= reverse). APPLICAZIONI Identificazione dei telomeri di molti cromosomi (bandeggio T). Identificazione di fusioni tandem: utile nello studio dell’evoluzione cariotipica. Identificazione di anomalie cromosomiche umane che coinvolgono le regioni terminali dei bracci cromosomici, che appaiono chiare con i bandeggi Q e G. BANDEGGIO di REPLICAZIONE (RBA, RBG) Il bandeggio R può essere ottenuto anche utilizzando la 5-bromodeossiuridina (5-BrdU) (nel caso del RBG a replicazione tardiva). Questo bandeggio sfrutta la proprietà della 5-BrdU di venire incorporata nel DNA al posto della timidina. Bandeggio noto come RBA o RBG a seconda che come colorante si usi l’Arancio di Acridina o il Giemsa. Questo metodo sfrutta il fatto che differenti regioni cromosomiche vengono replicate in momenti diversi della fase S. La 5-BrdU viene aggiunta al terreno di coltura e incorporata nel DNA dei cromosomi che si replicano. I preparati cromosomici vengono esposti alla luce che genera una fotolisi della 5-BrdU. A causa dell’effetto fotolitico, le regioni che hanno incorporato la 5-BrdU appariranno debolmente colorate.

Si possono ottenere due diversi pattern di bandeggio: Bandeggio di replicazione tardiva (B-pulse): la 5-BrdU è aggiunta alla coltura 5-6 ore prima di fare il preparato metafasico (aggiunta di colcemid). La 5-BrdU verrà incorporata nel DNA a replicazione tardiva (DNA evidenziato dalle bande Q e G). Il DNA a replicazione tardiva risulterà poco colorato a causa dell’effetto fotolitico, mentre le bande colorate intensamente corrisponderanno alla cromatina a replicazione precoce (bande R): pattern tipo bandeggio R. Bandeggio di replicazione precoce (T-pulse): la 5-BrdU è aggiunta all’inizio della coltura e rimossa 5-6 ore prima di fare il preparato metafasico (aggiunta di colcemid). La 5-BrdU verrà incorporata nel DNA a replicazione precoce (DNA evidenziato dalle bande R).

Il DNA a replicazione precoce risulterà poco colorato a causa dell’effetto fotolitico, mentre le bande colorate intensamente corrisponderanno alla cromatina a replicazione tardiva (bande Q/G): pattern tipo bandeggio Q/G. BANDEGGIO di REPLICAZIONE E’ molto utile per identificare il cromosoma X a replicazione precoce (X attivo) e quello a replicazione tardiva (X inattivo). E’ utile per studiare pazienti con anomalie cromosomiche a carico dei cromosomi sessuali. Questa metodica è usata anche per evidenziare gli Scambi tra Cromatidi Fratelli (Sisters Chromatid Exchange: SCE). Fisiologicamente 6-7 scambi per cellula (nell’uomo). Aumentano con l’età (incidenza più alta tra i 30 e i 40 anni) SCE Sisters Chromatid Exchange: meccanismo In condizioni patologiche o in presenza di agenti mutageni, il numero di SCE aumenta. Il numero di SCE rappresenta un indicatore molto sensibile del danno al DNA. Il danno al DNA provocato dalla luce UV può manifestarsi con un aumento di SCE. M1: dopo un ciclo di replicazione, 5-BrdU in una sola catena in ciascun cromatidio. M2: dopo due cicli di replicazione, un cromatidio con entrambe le catene con 5-BrdU (chiaro), l’altro con una catena normale e l’altra con 5-BrdU (scuro).

Bandeggio AgNOR Metodo che evidenzia le Regione dell’Organizzatore Nucleolare sui cromosomi metafasici. I cromosomi metafasici vengono trattati con nitrato d’argento. L’argento impregna le costrizioni secondarie che appaiono come sfere di colore nero. LA REGIONE DELL’ORGANIZZATORE NUCLEOLARE (NOR) Come si identifica? •Colorazione con nitrato d’argento (Silver Staining). • Evidenzia solo i siti che sono trascrizionalmente attivi.

Perché? A livello dei siti NOR dei cromosomi in metafase vengono solo trattenute le proteine argirofile che hanno un ruolo nel processo di trascrizione, mentre durante l’interfase il nitrato di argento può andare a colorare molte altre proteine non necessariamente connesse con la trascrizione. Il bandeggio AgNOR è una Tecnica di facile applicazione e di elevata riproducibilità. E’ un metodo di bandeggio importante per studiare variazioni nel numero e dimensione dei NOR, e per studiare altri riarrangiamenti che possono coinvolgere questi cromosomi. Valutazione di condizioni patologiche Differenze nel numero di ripetizioni tra cromosomi omologhi che portano il NOR. Nell’Homo sapiens: •NOR su 5 coppie (13, 14, 15, 21, 22) •Condizione normale: 3-7 siti attivi (silver staining) (media  5) •Stati patologici: tutti i siti attivi. •Riarrangiamenti cromosomici che coinvolgono uno dei cromosomi NOR: tutti i siti sono attivi (es. trisomia 21: 11 siti attivi) •Riarrangiamenti che non coinvolgono cromosomi NOR: pattern di espressione normale

Bandeggio C (metodo CBG) Metodo di bandeggio che evidenzia l’eterocromatina costitutiva. Pretrattamento denaturante dei cromosomi con Idrossido di Bario [Ba(OH)2]. Messo a punto nel 1972 da Sumner, il quale sostituì l’NaOH (Arrighi & Hsu, 1971) con il Ba(OH)2, denaturante più blando. Il Ba(OH)2 consente di prolungare i tempi di denaturazione controllando meglio il processo che diviene così molto riproducibile. Estrazione di DNA e nucleoproteine dalle regioni eucromatiche. Le regioni eterocromatiche rinaturano rapidamente una volta che i cromosomi sono tolti dal Ba(OH)2. Il DNA non eterocromatico a singolo filamento viene estratto durante il passaggio in 2xSSC ad alta temperatura (60-65°C). Sembra che le proteine non istoniche rimangano associate alle regioni eterocromatiche. Le regioni eterocromatiche si colorano intensamente con il Giemsa. Questa colorazione differenziale è probabilmente da imputare alla maggiore quantità di DNA che rimane nelle regioni eterocromatiche. Il bandeggio C E’ utile per capire se la lunghezza anomala di un braccio cromosomico dipende dall’aumento di una banda eterocromatica o da una traslocazione. Pattern di bande come indicatore di affinità filogenetica. Nelle piante sono numerose e variamente collocate lungo il cromosoma: utili per identificare riarrangiamenti cromosomici. I Bandeggi ad alta risoluzione Sono necessari cromosomi allungati sui quali evidenziare bande e sottobande. E’ necessario ottenere un elevato indice mitotico. Vengono usate sostanze per sincronizzare le colture (metotrexato). Vengono usate sostanze che permettono di avere cromosomi allungati (es. bromuro di etidio).

Qualità del bandeggio: numero di bande ottenute. ISCN (1985): 4 gradi di bandeggiamento Grado 1 (circa 150 bande visibili) Grado 2 (circa 400 bande visibili) Grado 3 (circa 550 bande visibili) Grado 4 (circa 850 bande visibili) Indice di risoluzione ulteriormente aumentato dopo il 1985....