19) Operone triptofano + tecnica della jumping (o joining) library PDF

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Biologia molecolare...

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16-05-17 Come si è capito il funzionamento dell’operone? Effettuando tutt’una serie di prove e seguendo la trascrizione in vitro. In assenza di cAMP e in assenza di induttore, viene sicuramente usato il glucosio, quindi il repressore LAC si legherà al sito operatore. L’RNApol non si potrà legare. Presenza di cAMP e assenza di induttore, il repressore si legherà al sito operatore e la proteina CAP si potrà anch’essa legare, ma non potrà avvenire la trascrizione. Infatti, in questo caso, non ci sarà né glucosio ma neanche lattosio poiché sarà stato aggiunto un altro zucchero. Assenza di cAMP e presenza dell’induttore viene usato un induttore sintetico, isopropil-tiogalattoside. In questo caso il repressore si staccherà, si potrà legare la RNApol ma avverrà trascrizione a livelli molto bassi perché mancherà la proteina CAP. Presenza di cAMP e presenza di induttore, il repressore si staccherà, la RNApol si sarà legata, si legherà anche l’attivatore e inizierà la trascrizione con elevata efficienza.

Come capire se in un mutante è alterato il sito operatore o il gene regolativo? Si preparano delle cellule diploidi parziali, ovvero mutanti in cui non sappiamo se la mutazione ha alterato il sito operatore o il gene regolativo, ma nei quali abbiamo fatto entrare un costrutto che conterrà tutto l’operone LAC e il gene regolativo wild type. Sarà definito diploide parziale perché la diploidia riguarderà solo la regione dell’operone LAC e il gene regolativo, mentre tutto il resto sarà aploide, così come dovrebbe essere in una normale cellula batterica. Se sarà mutato il gene regolativo, il cromosoma del mutante conterrà un gene regolativo mutato che non codificherà per un repressore funzionante quindi, il repressore non si potrà legare al sito operatore. Nel diploide parziale tuttavia il gene regolativo funzionerà perché sarà wildtype; ciò vorrà dire che verrà trascritto e tradotto e si formerà un repressore funzionante. Esso potrà diffondere sia verso il sito operatore del costrutto, sia verso il sito operatore del cromosoma batterico mutante. Quindi bloccherà la trascrizione in entrambi i cromosomi. Questa mutazione di LacI nel diploide parziale sarà recessiva, perché in condizione di eterozigosi non si manifesterebbe. Se invece muterà il sito operatore nel mutante, il gene regolativo funzionerà sia sul costrutto che sul cromosoma e quindi produrrebbe il repressore. Ma il repressore potrà legarsi SOLO al sito operatore del costrutto che sarà wild type, mentre al sito operatore del cromosoma mutante non potrà legarsi. Nel diploide parziale l’operone del lattosio verrà trascritto in qualsiasi condizione nutrizionale (cioè sempre) e avrà dunque una espressione costitutiva. Il mutante OC (operatore costitutivo) sarà dominante sul wild type, perché anche in situazioni di eterozigosi si manifesterà il mutante OC. Sarà quindi possibile distinguere con i diploidi parziali, le mutazioni OC (del sito operatore) dalle mutazioni del gene regolativo che codificherà per il repressore.

OPERONE DEL TRIPTOFANO Esso ha 5 geni: trpE, trpD, trpC, trpB, trpA in successione. Sono trascritti a partire dallo stesso promotore in un unico trascritto, dove il promotore si sovrappone parzialmente col sito operatore. Nella sua regolazione vi è una regolazione negativa mediata dal repressore (attivato dal trp che si chiama “co-repressore”): normalmente la cellula produce trp, ma se aggiungessimo noi trp al terreno, la cellula non avrebbe più questa necessità e il trp co-repressore si legherebbe al repressore formando un complesso attivo che si legherebbe al sito operatore e ne bloccherebbe fisicamente la trascrizione. Esiste anche un secondo meccanismo di regolazione molto fine: è il meccanismo dell’ATTENUAZIONE. Grazie a questo meccanismo la cellula è sensibile alle variazioni di concentrazione di trp. Esiste un sistema grazie al quale la cellula percepisce se il trp sia presente ed abbondante oppure se inizia a scarseggiare.

I 5 geni codificano per 5 enzimi coinvolti nella via metabolica di sintesi del trp. A monte del primo gene, il trpE, c’è una regione leader che viene trascritta e che ha caratteristiche particolari: è formata da 161 nucleotidi quando viene trascritta, ma presenta una regione 1 che si appaia perché presenta complementarietà intracatena con la regione 2, e una regione 3 che si potrebbe appaiare con la regione 4 sempre per complementarietà intracatena. Inoltre, esiste una parziale complementarietà tra la regione 2 e la 3. A monte della regione 1 inizia una ORF che si estende nella regione 1 per una estensione di 14 codoni che codificano per 14 aa. Questa ORF può essere tradotta producendo il PEPIDE LEADER che svolge una funzione regolativa: dopo che viene tradotto viene anche degradato. Come funziona? Quando c’è trp nel terreno, il trp impedisce la trascrizione anche quella della regione leader. Ammettendo di aver aggiunto trp in un secondo momento dall’inizio della trascrizione, succederà che inizierà la trascrizione della sequenza leader e man mano che la regione 1 si appaierà con la regione 2 e la regione 3 si appaierà con la regione 4. L’appaiamento della regione 3 con la regione 4 creerà una ansa di terminazione, caratterizzata da una struttura a forcina con appaiamenti G-C nello stelo, un loop e una sequela di U nella parte terminale della forcina. Questa struttura sarà un segnale per la RNApol che si bloccherà a livello si essa. La RNApol sosterà per un minuto in prossimità della forcina e questa sosta determinerà il distacco del trascritto dallo stampo e di conseguenza la terminazione della trascrizione. Questo avviene al 139° nucleotide che si chiama SITO DI ATTENUAZIONE. Viene definita “Ansa di terminazione ρ indipendente” perché nella cellula batterica per terminare la trascrizione ci possono essere 2 tipi di anse di terminazione: questa che si crea nell’operone del trp “ρ indipendente” caratterizzata dall’appaiamento nello stelo ma dalla sequenza di U e l’ansa di terminazione “rho dipendente”, caso in cui non c’è la sequenza di U ma un fattore di terminazione ρ che va a bloccare la RNApol in corrispondenza dell’ansa. Il segnale sarà quindi la formazione di questa struttura e nel trp le U sono importanti affinché avvenga la dissociazione e si blocchi la trascrizione. La sequenza di U infatti durante la trascrizione, quando si formerà l’ibrido DNA stampo-RNA, l’ibrido che si formerà sarà molto debole in quanto le basi A-U saranno unite da due legami H che rendono la catena meno stabile. La sosta della RNApol nei pressi della forcina causerà una dissociazione dell’ibrido della regione che si starà allungando e quindi verrà rilasciato il trascritto che si starà sintetizzando: esso si staccherà e sarà composto da 139 nucleotidi. La trascrizione quindi si fermerà. Inoltre, sarà presente trp e non avrà senso che venga trascritto l’operone. Quando il trp inizierà a scarseggiare verrà innescato un meccanismo molecolare grazie al quale la cellula si accorgerà che il trp scarseggia e provvederà: partirà la trascrizione e inizierà ad essere trascritta la regione 1 e nel frattempo avverrà anche la sua traduzione. In questo caso però nel trascritto di questa ORF ci saranno all’inizio della regione 1, due codoni per trp. Il ribosoma che starà traducendo il peptide leader, arriverà in prossimità di questi due codoni e si fermerà perché il trp starà scarseggiando nella cellula. Il tRNA carico di trp diffonderà nel sito A del ribosoma, in corrispondenza del suo codone, molto più lentamente, perché sarà difficile racimolarlo. Il ribosoma dunque occuperà tutta la regione 1 e resterà fermo in attesa che arrivi il tRNA col trp. L’RNApol continuerà, comunque, a trascrivere la regione 2 e 3. Se la regione 1 sarà occupata, la regione 2 si potrà appaiare con la regione 3, con cui avrà parziale complementarietà.

Questo impedirà, inoltre, l’appaiamento tra la regione 3 e la regione 4 e quindi non si fermerà l’ansa di terminazione. La RNApol continuerà così la trascrizione, andrà oltre il 139° nucleotide, arriverà al 161° e continuerà a trascrivere l’operone del trp. Sarà infatti necessario sintetizzare trp. L’attenuazione è comune anche verso altri operoni che codificano per aa. Infatti, nella sequenza leader di questi operoni, sono stati trovati codoni per aa specifici. Per esempio, nella sequenza leader dell’operone treonina, ci saranno una serie di codoni per la treonina; nella sequenza leader dell’operone istidina, ci saranno codoni per istidina, così come per l’operone leucina e per l’operone fenilalanina. Nell’operone del lattosio la trascrizione parte dal promotore e il trascritto è policistronico, ovvero un unico trascritto che contiene tre cistroni che verranno poi tradotti. Ma la quantità di proteina dei tre enzimi che si ottiene (β-galattosidasi, β-galattoside-permeasi e βgalattoside-acetilasi) non è la stessa, nel senso che i tre enzimi vengono sintetizzati in quantità diverse, in rapporto pari a 1: 1/2: 1/5 ciò significa che ogni 100 molecole di β-galattosidasi, ne vengono sintetizzate 50 di β-galattoside-permeasi e 20 di β-galattoside-acetilasi, a partire dallo stesso trascritto. Come è possibile? Le sequenze di Shine-Dalgarno a monte di AUG delle tre ORF potrebbero essere meno simili a quelle ideali e il riconoscimento potrebbe essere meno efficace nel 2° e ancora di più nel 3° cistrone. Oppure essendoci la possibilità di usare codoni sinonimi: nel primo caso potrebbero essere usati specie di tRNA molto abbondanti in cellula e la traduzione sarebbe molto rapida e verrebbe tradotto più volte, mentre la seconda e la terza regione può essere possibile che si siano formati da codoni sinonimi che corrispondono a specie di tRNA minori, poco abbondanti in cellula; di conseguenza la traduzione è rallentata e si produce meno proteina. Principali fattori di regolazione: - Struttura del gene - Presenza di introni/esoni - Efficienza dei promotori (promotore forti/deboli) - Velocità dei ribosomi sul trascritto, che dipende da una serie di fattori:  dal riconoscimento dell’estremità 5’ del trascritto grazie al CAP  dall’uso dei codoni  dalla stabilità del trascritto stesso, che determinerà il suo turn over: se il trascritto ha turn over elevato, verrà degradato rapidamente, se il turn over è basso, allora sarà molto stabile. (per seguire un turn over si segue l’emivita chimica del trascritto, da 1h a 12h). Quanto più è stabile un trascritto, tanto più sarà tradotto. Alla stabilità contribuirà anche la coda di poliA che verrà costantemente allungata e accorciata. Quando arriverà ad almeno 30 nucleotidi inizierà la degradazione. - Splicing, l’eliminazione degli introni dal trascritto precursore. Se tutti gli introni non sono eliminati, non può essere trasportato dal nucleo al citosol dove avviene la traduzione. In alcuni casi lo splicing è differenziale cioè, l’introne in alcuni trascritti non viene eliminato completamente e quindi il trascritto maturo è diverso dal solito. Grazie a questo splicing, da un unico precursore si possono ottenere molti messaggeri maturi. Per esempio, in Adonovirus (eucariotico, genera i raffreddori nell’uomo) da un trascritto precursore tardivo di circa ventottomila nucleotidi, con lo splicing differenziale si possono ottenere ben 20 messaggeri maturi diversi. In alcuni casi alcuni gli introni sono rimossi più lentamente di altri perché al loro interno ci sono sequenze SILENCER che inibiscono/ritardano lo splicing; in altri introni invece possono esserci sequenze ENANCER che invece attivano lo splicing, facendolo avvenire più rapidamente. - Metilazione, ha significato diverso rispetto alla metilazione del DNA nei procarioti. Nei procarioti serve per proteggere il genoma del batterio dall’enzima di restrizione che esso stesso produce (sistema restrizione/metilazione). Negli eucarioti invece la metilazione di alcune basi (soprattutto coppie G-C dette ISOLE G-C) nella regione promotore, determina un’inibizione della trascrizione e quindi un blocco dell’espressione genica.

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Quindi un DNA molto metilato nel promotore (iper-metilato) non viene trascritto, mentre la demetilazione promuove la trascrizione, tanto che si è pensato di utilizzare come target di metilazione i promotori degli oncogeni, in modo da reprimerli o demetilare i geni degli oncosoppressori per attivarli. Impacchettamento della cromatina, se è fortemente compattata (eterocromatina) i geni non vengono mai espressi. Per essere espressi è necessario che essa si decondensi e si despiralizzi in modo da formare l’eucromatina, in cui si possono avviare i processi di attivazione dell’espressione genica. Fattori di trascrizione che si legano nelle regioni enancer. La mancanza di un fattore impedisce verosimilmente la trascrizione. È meno diffusa la presenza di repressori veri e propri, ma si formano complessi di repressione o l’assenza di particolari complessi di attivazione provoca una inibizione della trascrizione. I fattori che legano specifiche sequenze consenso sul DNA, sono stati raggruppati in classi a seconda del dominio con cui si legano al DNA. Ci sono per esempio dei fattori con dominio particolare “elicacurva-elica” che sono stati raggruppati tutti in una classe; oppure “elica-ansa-elica” è un’altra classe o ancora “proteine zinco-finger” a dita di zinco, che hanno un dominio in cui c’è un atomo di zinco al centro che forma legami di coordinazione con specifici aa formando una struttura a dito che interagisce col DNA; o ancora “leucina-zipper” che hanno un dominio formato da una cerniera di leucine che interagiscono col DNA.

JUMPING/JOINING LIBRARY Ci sono tanti tipi di vettori di clonaggio (non solo plasmidi ma anche vettore del fago lambda definiti cosmidi, un misto tra plasmide e fago lambda, i cromosomi artificiali di lievito e anche cromosomi artificiali di mammifero). Questi vettori sono stati ottenuti e manipolati dagli operatori per renderli più versatili a inserire tra le loro estremità frammenti sempre più grandi. I plasmidi possono inserire in media inserti di 10-12mila pb, a volte si riesce ad arrivare a circa 20mila pb, ma si crea un costrutto abbastanza instabile. Per clonare frammenti stabili sempre più grandi, di 15-18 kpb si usa il fago lambda; per dimensioni di 30-40 kpb si può usare il cosmide. Via via che le dimensioni aumentano si deve quindi passare a vettori più complessi, come i cromosomi artificiali. Ma come è possibile costruire delle mappe fisiche di genomi complessi difficili da tagliare con enzimi di restrizione perché generano frammenti molto grandi impossibili da clonare? Un genoma che può essere tagliato solo dall’enzima Not1, enzima che taglia molto raramente, dà frammenti di 800 kpb e non sono clonabili. È necessario quindi adottare una strategia diversa per costruire la mappa fisica di questi genomi. Una volta che il genoma viene tagliato con Not1 e ha dato frammenti grandi circa 800 kpb, possiamo mettere questi frammenti in provetta, aggiungere la ligasi e un gene reporter che verrà ligato tra le estremità di ogni frammento in modo tale che i frammenti vengano circolarizzati. Indicheremo arbitrariamente le estremità delle regioni che si trovano nelle immediate vicinanze del sito Not (A, B, C, D, E, F). A causa della circolarizzazione dei frammenti, la regione A si è avvicinata alla regione B, la quale sarà separata dal gene reporter che è un gene piccolo di circa 1000 pb. In questo modo, la regione A che in genere disterà 800 kpb dalla B, sarà molto vicina ad essa, così come le regioni C e D, E ed F.

A questo punto taglieremo questi frammenti con un enzima che taglierà molto frequentemente, per esempio BamH1 e otterremo tutt’una serie di frammenti piccoli che potremo clonare in un vettore e ovviamente selezionando i vettori che conterranno il gene reporter (R). Verrà in questo modo costruita una JUMPING LIBRARY, ovvero una genoteca costruita per salto. Infatti, avremo clonato regioni che distano sul genoma di circa 800 kpb. A monte di A e a valle di B, tuttavia non sapremo cosa ci sarà. Per questo motivo dovremmo costruire un’altra genoteca detta “genoteca di giunzione” o JOINING LIBRARY. Per farlo bisognerà nuovamente tagliare il genoma con un altro enzima (per esempio SF1) e di tutti i frammenti che otterremo dovremo selezionare solo quelli che avranno al loro interno il sito Not: i frammenti ottenuti col secondo enzima, se verranno sottoposti al doppio taglio, dovranno ridursi di dimensioni. Trattandoli con il primo enzima e con Not insieme, un frammento SF1 verrà ridotto di dimensioni se avrà al suo interno un sito Not. A noi ovviamente interesseranno solo i frammenti che, tagliati con entrambi gli enzimi, diventeranno più piccoli rispetto a quelli che si otterranno col taglio singolo. Questi frammenti abbastanza piccoli, si potranno clonare e formeranno la JOINING LIBRARY.

Si procederà quindi con le ibridazioni: prenderemo un clone della jumping library e lo ibrideremo con tutti i cloni della joining library. Il clone che conterrà la regione A_B ibriderà sicuramente con la regione A di A_X, ma anche con la regione B di B_C. Si capirà quindi che affianco alla regione B ci sarà la regione C e a monte della regione A ci sarà la regione X. Questi due cloni trovati dalla joining verranno ibridati con tutti i cloni della jumping: il clone A_X ibriderà non solo con quello A_B della jumping, ma anche con il clone X_Y, sempre della jumping, che sta più a monte. Il clone B_C della joining ibriderà non solo con il clone A_B della jumping, ma anche con il clone C_D della jumping. Si procede quindi con ibridazioni alternate: un clone della jumping con tutti i cloni della joining; i cloni identificati della joining con tutti i cloni della jumping. Questo ci permetterà di camminare sul cromosoma e determinare i siti di taglio di tutti gli enzimi nel cromosoma....