2 - Réplication de l\'ADN chez les eucaryotes PDF

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Cours sur la réplication eucaryotes ...

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Chapitre 2 : REPLICATION DE L’ADN CHEZ LES EUCARYOTES I. Introduction Le mécanisme de la réplication est quasiment tout le temps conservé chez les eucaryotes. On a un mécanisme semi-conservatif et bidirectionnel. La réplication se fait en recopiant les 2 brins parentaux. L’ADN fille est constitué d’un brin parental et d’un brin néo-synthétisé. On va avoir 2 complexes qui vont se mettre en place et vont fonctionner en sens opposé. Pour que la réplication soit possible, on a besoin d’enzymes, d’ADN polymérase. Elles vont polymériser un brin en recopiant une matrice. Ces enzymes nécessitent une matrice d’ADN monocaténaire et une amorce 3’-OH. Les 2 brins sont répliqués presque simultanément, au niveau de la fourche de réplication, tout en sachant que les 2 brins ont des orientations différentes Spécificités liées aux génomes eucaryotes: • Taille des génomes : Coli = 4 millions pb, eucaryotes = 2/4 milliars • Structure chromatinienne : chez les eucaryotes l’ADN est associé à des histones qui vont être un frein à la réplication • ADN linéaire (télomères) : le mécanisme réplicatif ne permet pas de répliquer l’intégralité du télomère Le cycle cellulaire est divisé en 4 phases : ➢ G1 : la cellule ne fait rien ➢ S : synthèse = réplication, on a un doublement de la quantité du génome nucléaire. Entre les 2, c’est le point de contrôle, contrôlé pour que la cellule ne se réplique pas de manière anarchique. Certains facteurs vont déclencher cette phase S. Elle dure 8h ➢ G2 : phase de pré-mitose. La cellule engendre la mise en place des éléments pour que la division cellulaire puissent avoir lieu. Elle va synthétiser des histone ➢ M : phase de mitose

Mécanisme semi-conservatif : Divisions donc les brins se divise complètement. Le mécanisme est basé sur une extension de 5’ vers 3’. But de la réplication : ADN fille identique au parentale et pour cela il faut recopier l’ADN parentale base par base.

ADN bactérien circulaire : Il y a un seul site de réplication pour les bactérie. Chez les eucaryotes on a de très nombreux site de réplication Pourquoi il y a plusieurs sites ? C’est lié à la taille du génome. En ayant plus d’origine de réplication, la réplication peut se faire plus rapidement. On réplique 2000 molécule par secondes

Modèle de réplication bidirectionnel de l’ADN chez les eucaryotes Il faut avoir des système de réparations qui permettent de rassembler les différents fragment qui se sont formés

II. ADN polymérase Chez les eucaryotes on a dénombré au moins 15 ADN polymérase Ce sont des ADN polymérase, de 5’ vers 3’ en utilisant un brin d’ADN monocaténaire, recopié dans le sens anti-complémentaire. 5’->3’ ADN polymérases ADN dépendantes • pol γ = spécialisé, elle réplique l’ADN mitochondriale pour permettre la multiplication des mitochondries •

pol β = enzymes de réparation de l’ADN. Elle intervient à tout moment sur l’ADN, à chaque fois qu’il y a une cassure, de manière à maintenir l’intégrité de la molécule.

•

pol ε = elle réplique le brin précoce. ➢ enzyme processive ➢ reste fixé sur l’ADN et est maintenu par un complexe protéique spécifique ➢ possède une activité d’auto correction 3’→5’, qui lui permet d’éliminer un désoxynucléotide non complémentaire qui est là par erreur.

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pol δ = brin retardé ➢ processive ➢ possède une activité 3'→5'

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pol α = enzyme hybride, 2 activités de polymérisation ➢ agit comme une primase (synthétisant une amorce d’ARN) ➢ puis comme une ADN polymérase allongeant cette amorce avec des dNMP. ➢ constituée de quatre sous-unités : ✔ la sous-unité catalytique POLA1 ✔ la sous-unité régulatrice POLA2 ✔ la petite et la grande sous-unité de la primase, PRIM1 et PRIM2 ➢ C’est une enzyme qui a évolué au cours de l’évolution. ➢ indispensable, peu processive. ➢ Quand elle se détache elle est remplacée par l’ADN polymérase δ

Ces 2 dernières enzymes sont indépendantes (contraire chez la bactérie) Seules les ADN polymérases γ, δ et ε ont une activité d’autocorrection (3'->5' exonucléase). Aucune des ADN polymérases eucaryotes n’a la capacité d’enlever les amorces d’ARN (pas d’activité 5'->3' exonucléase), cette étape est assurée par d’autres enzymes (FEN1, RNAse H). Les autres vont agir sur les zones endommagés de l’ADN. Il y a des altérations spontanées, ou provoquer par des évènement environnementaux, qui vont altérer les bases. Il existe des systèmes de réparation mais si ces erreurs persistent au moment de la réplication alors la réplication n’est pas possible. De manière à éviter ça, il y a des enzymes qui vont être impliqués dans la réplication des zones endommagées de l’ADN.

Activité 5’→3’ ADN polymérase, ADN dépendante Mécanisme identique chez les bactéries et eucaryotes

Modèle de la fonction d’autocoreection des ADN polymérases

Ça se déplace pas très vite : 250-300 nucléotides par secondes chez les eucaryotes. C’est lié à la structure chromatidienne, mais aussi au fait que la structure est liée à des complexes histone

Chez les eucaryotes on retrouve une PCNA, protéines constitué de 3 sous unités. Lorsqu’elle s’apparie ça forme un port qui permet de laisser passer la double hélice d’ADN à l’intérieur

III.Autres protéines intervenant au niveau de la fourche de réplication Le plus compliqué pour répliquer l’ADN c’est de séparer les 2 brins de l’ADN parental, parce que l’ADN parental est éminament structuré. D’un point de vu expérimentale, si on veut séparer le double brin, il faut le placer dans un tube à essai avec une quantité d’énergie très importante. Il faut donc une machinerie très importante.

Complexe MCG (MCM – cdc45 – GINS) : complexe hélicase qui permet la séparation des 2 brins de la double hélice avant le passage des ADN polymérases. MCG hydrolyse l’ATP et progresse d’environ 300 nucléotides par seconde Elles utilisent l’ATP pour entraîner un mouvement dan la molécules. RFC (replication factor C - clamp loader) : le chargeur de pince permet l’ouverture et la mise en place de PCNA Déroulases RPA (replication protein A) : protéines qui n’ont pas d’activité catalytique mais sont capable de se fixer sur l’ADN monocaténaire et vont empêcher de reformer des doubles brins. Empêchent la formation de structures secondaires et protègent l’ADN simple brin de la dégradation. Topoisomérases : permettent d’éliminer les torsades positives qui s’accumulent en amont le la fourche de réplication et à l’ADN néo-synthétisée de se ré-enrouler correctement après le passage des ADN polymérases. RNAses FEN1 et RNAse H : éliminent les amorces d’ARN. ADN ligase Lig1 : reforme les liaisons phosphodiesters entre les fragments d’Hokazaki après l’élimination des amorces d’ARN.

Activité hélicase 6 sous unités, va être capable de séparer les 2 brins en hydrolysant l’ATP et en ayant en mouvement d’oscillation L’ADN va rester enroulé cdc 45= verouille le bloc hélicase

Mécanisme d'action de l'ADN gyrase (topoisomérases de type II)

La progression de l’hélicase nécessite un déroulement rapide de la double hélice Les torsades (tour de spire, vont s’accumuler. Pour les éliminer il faut des topoisomérase La torsade + va être transformer en torsade -

Il faut ensuite un ré-enroulement de l’ADN, moins problématique que le dés-enroulement parce que c’est thermodynamiquement favorable. A l’issu de la réplication, elle va se réenrouler automatiquement mais parfois imparfaitement. Il faut donc d’autre enzymes = topoisomérase de type 1, qui vont éliminer les trosades -

Les déroulases Elles vont empêcher l’ADN monocaténaires de former des structures secondaires. Elles se fixent le long de l’ADN qui interagit au niveau du squelette phosphoribose et pas au niveau des bases. Les déroulases stabilisent l’ADN simple brin IV. Mécanisme général Les ADN polymérase vont polymériser dans le sens 5’→3’. Il va donc y avoir 2 mécanismes. Fusion puis synthèse. Ici du haut vers le bas donc déplacement continue DE l’autre coté, la synthèse se fait en sens inverse, donc en remontant, en sens inverse de la fourche de réplication. La synthèse ne peut pas avoir lieu en m^me temps que le déplacement de la fourche. Ça peut pas se faire en un seul morceau = fragment d’Okasaki. C’est donc synthétisé par petit morceaux.Action de l’ADN polymérase alpha puis delta sui va synthétiser. Mécanisme continue (brin précoce), puis mécanisme discontinue (brin tardif). Fragment initié par une amorce d’ARN.

Pourquoi ? Toutes les ADN polymérase ont besoin d’une amorce et d’une matrice. Donc les ARN polymérase permet de synthétiser cette amorce (ADN pas capable de la faire) Amorçage de la synthèse d’ADN chez les bactéries et les eucaryotes

Mécanisme de translation de césure L’élimination des amorces d’ARN est assuré par des ribonucléases qui vont être capable de digérer l’ARN La ligase permet de reformer une liaison phosphodiester (rouge)

ADN ligase = reformer une liaison phosphodiester. Pour cela la liaison phosphodiester a besoin d’un phosphate, un OH et entre les 2 il faut de l’énergie. La ligase va alors prendre de l’ATP et fixer de l’AMP

V. La fourche de réplication chez les eucaryotes En phase G1, il existe sur l’ADN des complexes de préréplication. Le seul problème c’est qu’on ne sait pas ou ça se fixe. Ces complexe sont capable d’intéragir avec l’hélicase (prémise), sous la forme MCM. Cdt 1 enpeche d’acquérir son activité hélicase à MCM

Le complexe pre-RC est formé des 5 protéines ORC (origin recognition complex), de Cdc6 (cell division cycle 6), et d’un hétérohexamère de 6 protéines MCM (MCM2-7) associé à la protéine Cdt1. Les séquences d’initiation de la réplication sont mal connues chez les eucaryotes. Seule la séquence de S. cerevisiae (TTTTTATG/ATTTA/T) est connue. Au démarrage de la phase S, la phosphorylation de Cdc6, de Cdt1 et de MCM par les kinases CDK (Cycline dependent kinase) et DDK (DBF4dependent kinase) libère le complexe MCM. Le complexe ORC est ensuite phosphorylé et éliminé de l’origine de réplication. Le complexe hélicase MCG se met en place par l’association de MCM, GINS et Cdc45, et fusionne l’ADN.

Brin tardif (bas) Les 2 ADN polymérases sont indépendantes l’une de l’autre.

Dans l’ADN d’une seule cellule, il y a beaucoup de réaction d’altération de l’ADN. ADN indépendant, elle s’en blc de la matrice, elle ajoute un nucléotide au hasard, ce qui permet de passer outre l’endommagement. Elle provoque une mutation et permet de continuer le brin sans matrice complémentaire.

VI. Particularités de la réplication ADN sous forme de chromatine, molécules linéaires Chez un eucaryotes la réplication se n’est pas seulement le doublement de l’ADN. Il faut aussi doubler la quantité d’histone puisque les molécules d’ADN filles doivent être associées à des histones pour former les chromosomes métaphasiques. Il y a donc une synthèse massive d’histone La structure du nucléosome est incompatible avec la réplication (8histones). Or il faut séparer les 2 brins mais pour cela il faut dissocuer les nucléosomes.

Rôles des chaperones des histones pendant la réplication Dissociation des histones du nucléosomes. Les histones qui été présent sur l’ADN parentale vont se ré-associer au brin précoce, qui vont être rejoint après par H2A et H2B pour reformer un nucléosome.

Réplication du télomère Séquence répétitive constituée d’ADN microsatellite. Il y a un problème, il provient du fait que le mécanisme réplicatif ne permet pas de répliquer la totalité du télomère. Il faut une amorce pour le brin du dessus Raccourcissement du télomère. Il existe donc un mécanisme qui fait intervenir la télomérase (pas réplicative), elle intervient avant la réplication. Elle va allonger l’extrémité 3’ des télomères. Elle va ajouter une séquence d’ARN pour synthétiser l’ADN. L’extrémité 3’ va être allongé et à la prochaine réplication il y aura un raccourcissement qui sera pallier par l’allongement avant.

TERC : 451 nucléotide rouge = séquence complémentaire qui va servir de matrice...