4 Metabolismo DE Nucleótidos (IV) PDF

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UAM 2º cuatri...

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METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS. En el metabolismo de nucleótidos interesa su síntesis, ya que la presencia de nucleótidos marca el flujo de síntesis de los ácidos nucleicos. Composición de los nucleótidos. Los nucleótidos están formados por una base nitrogenada (purina/pirimidina) unida a un azúcar (oxi/desoxirribosa) y ésta a su vez a un grupo fosfato. La síntesis de nucleótidos no ocurre mediante estos pasos (los componentes nunca van a encontrarse aislados en la célula, siempre van acompañados de intermediarios) pero sí ocurren en la degradación de los ácidos nucleicos que se reciben a través de la dieta. La base nitrogenada unida al azúcar forman el nucleósido, la unión con el fosfato da lugar al nucleótido. Las bases púricas son la adenina y la guanina:  

En la adenina se añade al anillo púrico un grupo amino en el carbono 6. En la guanina se añade un grupo ceto en C6 y un nitrógeno en C9.

Las bases pirimidínicas son la citosina, uracilo y timina:   

En la citosina, se añade un grupo ceto y un grupo amino. En el uracilo se añaden dos grupos ceto. En la timina se añaden dos grupos ceto y un grupo metilo, proviene del uracilo. Para añadir el metilo se utiliza un derivado del tetrahidrofolato, que se carga en las reacciones de ruptura de aminoácidos.

Los nucleótidos cumplen una gran variedad de funciones importantes en las células. Aparte de los nucleótidos que forman parte del DNA y RNA, existen otros nucleótidos importantes como el ATP (moneda de intercambio energético celular), AMP (mensajero celular relacionado con receptores -adrenérgicos y proteínas G), cofactores redox….   

Transportadores fundamentales de energía química, sobre todo en forma de ATP. Mensajeros secundarios como AMPc o GMPc. Componentes de cofactores implicados en funciones vitales de la célula: NAD +, FAD, CoA, S-adenosilmetionina.

Los nucleótidos son los sillares para la síntesis de ácidos nucleicos. Para el mantenimiento de la homeostasis de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos existen dos rutas complementarias de síntesis: La síntesis de novo de nucleótidos se lleva a cabo por una ruta cuya base se mantiene constante en toda la evolución de los seres vivos. Es una ruta universal, las variaciones se producen en las enzimas y por tanto en la regulación de las rutas. Es común desde bacterias a seres humanos y requiere ribosa-5-fosfato. Aparte de la síntesis de novo, existe una ruta de salvamento en la que se reciclan las bases nitrogenadas y se evita que se sigan degradando hasta productos de degradación. La degradación de nucleótidos– por ejemplo, los RNAm se renuevan de forma continua – es un proceso que no rinde mucha energía. En cambio, la síntesis es muy costosa y por ello se intenta

reutilizar lo máximo posible. Las rutas de salvamento constituyen la fuente principal de nucleótidos en organismos superiores. La mayoría de los alimentos contienen ácidos nucleicos. Solamente un 5% de lo que recibimos a través de la dieta se reutiliza para la síntesis de estructuras propias, el resto se pierde o es procesado por el intestino grueso y se excreta en la orina en forma de ácido úrico. El 5% que sí se utiliza se degrada en el intestino y en el duodeno mediante una digestión química por acción de endonucleasas pancreáticas (desoxirribonucleasas y ribonucleasas), fosfodiesterasas y nucleósido fosforilasas. El epitelio intestinal tiene fosfatasa alcalina y enzimas que degradan los nucleósidos. Esto se debe a que la síntesis de ácidos nucleicos depende únicamente de su demanda (no de la ingesta) y además no existe un reservorio celular para las bases nitrogenadas. En la célula existen reservorios de algunos nucleótidos, como el ATP.  Las purinas y pirimidinas son consideradas nutrientes no esenciales, ya que todos los organismos pueden sintetizar nucleótidos de purina y pirimidina “de novo”. Origen de carbonos y nitrógenos de las bases nitrogenadas. PIRIMIDINAS. Para sintetizar un anillo de pirimidina, se requiere una molécula de aspártico, el nitrógeno amida de la glutamina y una molécula de carbónico. Lo que se está formando es un carbamil-fosfato, en el que el grupo NH4+ no es libre sino que proviene de la glutamina. En este caso, la enzima carbamil-fosfato sintetasa II es citosólica.

PURINAS. Para sintetizar un anillo de purina, la célula requiere el grupo amino del aspártico, CO2, glicina, dos nitrógenos de una molécula de glutamina y dos formiatos (rinden un derivado del THF, cargados por la degradación de aminoácidos).

Las células que se dividen rápidamente necesitan grandes cantidades de RNA y DNA, estas células tienen grandes requerimientos de nucleótidos. Las vías de síntesis de nucleótidos son por tanto blancos atractivos para el tratamiento del cáncer y las infecciones por microorganismos. Al conocer las rutas de síntesis de las purinas y pirimidinas, se pueden utilizar determinados pasos como dianas terapéuticas. Muchos antibióticos y drogas anticancerígenas son inhibidores de la síntesis de nucleótidos. Son sustancias anticancerígenas moléculas como la azaserina o la acivicina, que actúan como análogos de la glutamina (tienen una estructura muy similar). Varias enzimas de la síntesis de nucleótidos utilizan glutamina y son un potente blanco para agentes anticancerígenos. Estas enzimas tienen actividad glutamina como amino-transferasa, catalizando la transferencia

dependiente de ATP del nitrógeno amídico de la glutamina a un aceptor. Estas moléculas por tanto van a actuar como inhibidores de la enzima glutamina amino-transferasa que sintetiza la glutamina. Con ello se inhibe la actividad enzimática y por tanto la síntesis de las bases nitrogenadas y se detiene el crecimiento celular. Otro método consiste en inhibir la actividad de la enzima que cataliza la transformación del folato en tetrahidrofolato. Por ejemplo, el metatotrexato inhibe la actividad de la dihidrofolato reductasa y con ello la entrada del metilo en la síntesis de bases púricas. Se utiliza en el tratamiento de la leucemia infantil y la artritis reumatoide. Los antifolatos tienen utilidad como drogas. Las células con mayor actividad proliferativa serán las mas afectadas por este tipo de tratamientos. Posteriormente, se deja un periodo de recuperación (se añade un suplemento de folato). De este modo los ciclos de quimioterapia hacen crecer diferencialmente las células normales y las tumorales. Por ello, las células normales que tienen un recambio mayor son las más afectadas por el tratamiento (células epiteliales, sanguíneas…). Síntesis de novo de precursores de purinas y pirimidinas. Las vías de síntesis de nucleótidos son similares en organismos tan divergentes como E. coli y humanos, lo cual muestra la unidad bioquímica de la vida. Ambas rutas tienen como intermediario la molécula de PRPP. La molécula de fosforibosil-pirofosfato (PRPP) es una molécula activada por la presencia de un enlace pirofosfato, que al romperse libera gran cantidad de energía. Su rotura se asocia por tanto a reacciones de síntesis. Las rutas de síntesis de purinas y pirimidinas utilizan el PRPP como intermediario (se ensamblan sobre la molécula). En purinas, el primer paso es la síntesis del PRPP y posteriormente se añaden la base nitrogenada y el fosfato, que se ensamblan sobre el PRPP. En cambio, en pirimidinas primero se sintetiza la base nitrogenada y después se une el azúcar. PIRIMIDINAS. La biosíntesis de pirimidinas es un proceso más simple que el de las purinas. Mediante experimentos de marcaje se pudo deducir el origen de los distintos átomos que constituyen el anillo. En el caso de las pirimidinas, primero se ensambla el anillo pirimidínico utilizando como precursores aspartato, glutamina y carbamoil-fosfato, y después se adiciona el residuo de ribosa-5-fosfato. La ruta de síntesis tiene un intermediario que es la molécula de ácido orótico.    

Aspártico. Nitrógeno de la glutamina. HCO3ATP

De la ruta de síntesis de pirimidinas son importantes las dos primeras reacciones, que actúan como reguladoras.

1. Síntesis de carbamoil-fosfato, mediante la actividad de la carbamil-fosfato sintetasa II. Esta enzima se encuentra en el citosol y utiliza la glutamina, H 2O, ATP y HCO3- para la síntesis de un acil fosfato activo. 2. Síntesis de carbamoil-aspartato, mediante la actividad de la aspartato transcarbamilasa. Se produce la entrada de la molécula de aspártico y su unión con el par libre de enlace del nitrógeno, siguiendo el mismo mecanismo de reacción que ocurría en el ciclo de la urea con la ornitina. En E. coli es aquí donde se localiza el control de toda la ruta.

3. Los pasos posteriores se centran en una serie de oxidaciones y formaciones de dobles enlaces que permiten cerrar el ciclo. La molécula de orotato es un intermediario de la ruta importante, ya que la enzima que cataliza su unión con PRPP (orotato fosforibosil-transferasa) está encargada de recuperar las bases nitrogenadas durante las rutas de salvamento. Cataliza la reacción de entrada de la fosforibosa para formar el nucleótido orotidina-5-monofosfato (OMP). El final de la ruta es la síntesis de uridina monofosfato (UMP), presente en el RNA. Regulación de la síntesis de pirimidinas. La ruta es idéntica en todos los seres vivos, únicamente varían las enzimas, fundamentalmente las que se encuentran en los puntos de control. El ATP activa la ruta: el ATP es un nucleótido de purina, y controla la síntesis de pirimidinas. Además de aportar carga energética, controla la síntesis de los nucleótidos que se van a emparejar con las purinas (la síntesis ha de estar balanceada). 

En E. coli el control se produce a nivel de la enzima aspartato transcarbamilasa (ATCasa) que cataliza la segunda reacción de la ruta. La inhibición la lleva a cabo el producto final (CTP) que actúa como modulador alostérico negativo.



En animales el control se ejerce sobre la carbamilfosfato sintetasa II que regula la entrada de los sustratos en el ciclo. Se inhibe por UTP, UDP y UMP. A nivel de UMP se regulan todas las enzimas previas.

En todos los organismos hay además un control asociado a la disponibilidad de PRPP, que actúa como activador. Dichos niveles están a su vez controlados por ADP y GDP. Cuando se acumula PRPP significa que no se está utilizando por lo que se activan las rutas que lo consumen y se acopla a las reacciones de síntesis de nucleótidos. Existe un balance entre la síntesis de novo de nucleótidos y las rutas de salvamento, por lo que los niveles de PRPP se mantienen siempre mas o menos constantes. Rutas de salvamento de pirimidinas. Al igual que en la ruta de recuperación de purinas, la enzima orotato fosforribosil-transferasa permite no solo recuperar el orotato, sino también otras bases nitrogenadas como la uridina y la citosina, convirtiéndolas en los nucleótidos correspondientes. La orotato fosforribosil-transferasa también actúa durante la síntesis de novo. Las reacciones que tienen lugar permiten la síntesis de un nucleótido de ribosa. PURINAS. Para la síntesis de purinas se necesita en primer lugar que el anillo purínico se forme y se ensamble con una ribosa. El derivado purínico que se sintetiza primero es el inosin monofosfato (IMP), únicamente con esta estructura se puede sintetizar el nucleótido púrico. La síntesis de IMP se lleva a cabo mediante una ruta metabólica con diez pasos que se inicia en presencia del azúcar de cinco carbonos fosforibosil-pirofosfato (PRPP). Sobre esta molécula los aminoácidos – glicina, glutamina, aspartato – van a actuar donando carbonos o nitrógenos. Todos los átomos de nitrógeno de las purinas derivan de estos aminoácidos:    

La glicina entra entera en la estructura. La glutamina cede un nitrógeno y sale en forma de fumarato. El aspártico cede su grupo amino y sale como fumarato. Además, para generar una purina se necesita N10 formil-tetrahidrofolato y carboxilos.

1. Formación del 5-fosforibosil--pirofosfato. En esta primera reacción, común a las rutas de síntesis de purinas y pirimidinas, se produce un ataque nucleofílico del grupo C1-OH sobre el P  del ATP pero a diferencia de lo que generalmente ocurre, el pirofosfato se incorpora a la molécula del azúcar para formar el 5fosforibosil--pirofosfato. 1. Síntesis del PRPP, molécula que resulta activa por el pirofosfato. Se forma en presencia de ATP. Se trata de una molécula altamente inestable por no poder estructurar su carga, tiende a romper su enlace. 2. Formación de fosfo-ribosa-pirofosfato. La ribosa-fosfato se fosforila con gasto de ATP que pasa a AMP, mediante la enzima ribosa-fosfato pirofosfoquinasa. Esta enzima ejerce control sobre la ruta: los niveles de PRPP regulan la síntesis de nucleótidos. 2. Ruta específica de la síntesis de purinas. Todas las estructuras y reacciones que tienen lugar van a ir encaminadas a la entrada de nitrógeno y carbono para formar el anillo púrico. 1. La primera reacción que tiene lugar transcurre en dos etapas:

a) Liberación del amonio y formación de glutámico. Se transfiere un grupo amino que cede la glutamina (donador universal de NH 3) al carbono 1 de la ribosa en posición alfa (sobre el enlace pirofosfato), formando fosforibosilamina. b) Se invierte la forma anomérica (ahora será ) y se incorpora el grupo amino origen del N9 de la purina. La enzima amido-fosforibosil-transferasa está sujeta a retroinhibición por nucleótidos purínicos. Este grupo amino es el que va a ir reaccionando con los grupos posteriores para formar la purina. 2. Entrada de la molécula de glicina completa sobre el NH2. Para que ocurra, se requiere la energía del ATP.

En las etapas subsiguientes entran más componentes que van añadiendo carbonos y nitrógenos sobre la estructura para formar el anillo. El final de la ruta es la formación de iosina monofosfato, molécula que no se encuentra en grandes cantidades en las células porque se convierte rápidamente en AMP y GMP. A partir de la IMP la ruta se bifurca: 1. Para llegar a la formación de AMP se ha de añadir amino y una molécula de aspartato. Se requiere la energía de una molécula de ATP. El aspartato entra completo en la estructura, el grupo amino permanece formando adenilosuccinato. Una liasa rompe la estructura, formándose fumarato y AMP. La molécula de aspartato solo participa cediendo el NH3 pero el resto de sus carbonos son reutilizados en el ciclo de Krebs. Parece que hace falta que una vez esté formada toda la estructura del AMP con la ribosa, en un momento determinado (en presencia de ATP) se forme por acción de quinasas y de una reductasa el desoxiribonucleótido, presente en el DNA. 2. El IMP también puede formar GMP. Mediante una reacción de deshidrogenación y agua se forma un grupo ceto. El NH3 en este caso lo rinde la glutamina, formando finalmente GMP. La glutamina se transforma a su vez en glutámico ya que únicamente se requiere su NH3.

Regulación de la síntesis de purinas.

Síntesis de PRPP. A la primera enzima reguladora (fosforibosil-pirofosfato sintetasa) la inhiben tanto el ADP como el GDP. Esto tiene como consecuencia un control balanceado también de la síntesis de pirimidinas con respecto a los niveles de purinas celulares. Síntesis de fosforibosil-amina. La segunda enzima reguladora (amido-fosforibosiltransferasa) se activa ante la presencia de PRPP que la estimula alostéricamente (activación por pre alimentación). Su concentración excesiva activa las rutas de síntesis tanto de purinas como de pirimidinas, que lo utilizan. También los nucleótidos AMP/ADP/ATP y GMP/GDP/GTP tienen sitios alostéricos sobre esta misma enzima, de forma que controlan independientemente pero de forma sinérgica su actividad. Después de la ramificación. La tercera enzima reguladora se encuentra en el punto de bifurcación tras la síntesis de IMP. Se trata de una enzima alostérica que tiene sitios de unión para todos los derivados del IMP: Tanto el AMP como el GMP son inhibidores de sus síntesis respectivas. Además el GTP estimula la síntesis del ATP y viceversa. Además, cada derivado cuando está en exceso cierra la ruta (desde arriba) por separado.

Rutas de salvamento de purinas. La mayor parte de las células tienen un recambio muy activo de ácidos nucleicos, durante la degradación liberan adenina, guanina e hipoxantina, que son reconvertidas a los nucleótidos

correspondientes gracias a la existencia de rutas de recuperación. En organismos superiores, tan importante es la síntesis de novo como la actividad de las rutas de salvamento. En mamíferos, las purinas se recuperan gracias a la acción de dos enzimas presentes en el citosol: 1. Hipoxantina-guaninafosforribosil transferasa (HGPRT). Rescata tanto la hipoxantina como la guanina. Una vez se rescatan las bases nitrogenadas se les añade PRPP y forman el nucleótido correspondiente. 2. Adeninafosforribosil transferasa (Adenina+ PRPPAMP + PPi) Cuando existe una deficiencia en la enzima HGPRTasa, se produce el síndrome de Lesh-Nyhan, ligado a la herencia del cromosoma X. Tiene consecuencias muy graves como deficiencias neurológicas, autolesiones o acumulación de ácido úrico en las articulaciones. El úrico se forma como resultado de la degradación de purinas: al no reciclarse la hipoxantina, se va a degradar totalmente, formando úrico. Además, el PRPP también se acumula. Como es un activador de síntesis de nucleótidos, actúa favoreciendo la síntesis de más que como no se necesitan, acaban degradándose igualmente a ácido úrico. SÍNTESIS DE DNA. Además de desoxirribonucleótidos, la síntesis de DNA requiere de la síntesis del nucleótido timina, que no está presente en el RNA. Para sintetizar un desoxirribonucleótido se requiere el ribonucleótido-fosfato previamente formado y la actividad de la enzima ribonucleótido-reductasa. Hay tres clases descritas, la de clase I de E. coli y eucariotas es la mejor conocida: Presenta dos subunidades R1 donde aparecen el sitio primario de regulación y el sitio de especificidad de sustrato y dos subunidades R2 donde se encuentran los aminoácidos requeridos para unir el sustrato y llevar a cabo las reacciones redox. Entre ambas subunidades se encuentra el sitio activo. En el sitio primario de regulación se puede unir una molécula de ATP o de desoxi-ATP. Si se une ATP la enzima se activa, en caso contrario se inhibe su actividad. Por tanto la molécula de ATP actúa abriendo o cerrando la actividad enzimática. En el sitio de especificidad de sustrato se puede unir cualquiera de los nucleótidos; dependiendo de cual se una se sintetiza preferentemente un nucleótido u otro. En el sitio activo se une cualquier ribonucleótido. El sitio de especificidad de sustrato actúa como mecanismo regulador indicando qué nucleótido se sintetiza. En el sitio XH se une el sustrato (cualquiera) y dos grupos SH en su forma reducida. Durante la reacción, la ribosa se reduce a desoxirribosa y los SH se oxidan. Para volver a reducir los SH, aparece una pequeña cadena transportadora de electrones que devuelve el poder reductor.

La molécula donadora de electrones es la tioredoxina, proteína pequeña que actúa como transportador móvil de electrones. Devuelve la capacidad catalítica a la ribonucleótidoreductasa. La tioredoxina queda entonces oxidada y es reducida de nuevo por la tioredoxinareductasa, que lleva unido un grupo prostético FADH 2 de forma covalente. Esta molécula es a su vez reducida por NADPH. La reducción de la ribosa para dar 2’-desoxrribosa requiere dos átomos de hidrógeno que en último término provienen del NADPH + H+.

Regulación de la ribonucleótido-reductasa. Esta enzima ha de tener muy regulada la síntesis de nucleótidos, que debe estar balanceada entre purinas y pirimidinas para permitir la síntesis en último término de DNA. Se lleva a cabo una regulación dependiente de sustrato.  

Sitio primario de regulación. La entrada de ATP provoca la activación de la formación de todos los nucleótidos. Si no hay ATP se cierra la actividad. Sitio de especificidad de sustrato. La entrada de ATP induce la reducción del GDP y UDP: abre la síntesis de dCTP y dTTP (pirimidinas). Si se tiene un exceso, dTTP induce la reducción del GDP (síntesis de dGTP) e inhibe la del UDP y CDP. Frente al exceso de dGTP, s...