6. SNAP SHOT - Apuntes 2 PDF

Preview

Summary

tecnicas...

Description

Deteccion SNPs por SNAPshot Snp es la variacion de 1 solo nucleotido, no es una mutacion (>1%) Fundamento MiniSecuenciacion de regiones ya conocidas, esta tecnica se realiza una vez se ha detectado ya el SNP y se ha amplificado el fragmento de DNA que lo contiene. Se basa en la utilizacion de una PCR, pero a diferencia de una PCR convencional en esta se utiliza didesoxinucleotidos marcados con fluorocromos, contaremos con un primer que se unira al nucleotido anterior a donde se encuentra el SNP (al extremo 5’) asi la primera base que se unira durante la replicaion será el SNP. La secuenciacion no continuará despues del SNP debido a la utilizacion de didesoxinucleotidos, debido a que en el extremo 3’ no contiene un grupo –OH si no que contiene un H que impide que se forme en enlace fosfodiester, que es el que une las bases entre si, Asi obtendremos cadenas donde la ultima base que se las ha unido será el SNP Cada base está marcada con un fluorocromo, de manera que cuando pasemos os resultados de nuestra PCR por una electroforesis capilar de densidad, obtendremos una señal que de fluorescencia nos inidicará que tipo de base contiene nuestro SNP

PROTOCOLO 1. determincaion de SNP in silico 2. PCR convencional (replicacion del fragmento de interes) 3. Purificacion 4. PCR de minisecuenciacion. Para poder detectar el SNP es necesaria una segunda PCR mas específica, añadimos un primer que termine antes del SNP de interes 5. Electroforesis capilar + detector . Una vez hecha esta PCR. Pasaremos a la solucion por un capilar de electroforesis, este capilar tendra un detector que leera la fluorescencia. PCR MULTIPLEX...