6FM1 P8 Farmacología secreción tubular activa PDF

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA GENERAL Y QUIMIOTERAPIAPRÁCTICA 8SECRECIÓN TUBULAR ACTIVA DEL ÁCIDO P-AMINOHIPÚRICO EN LAS REBANADAS DE LACORTEZA DE LA RATAII. OBJETIVO● Cuantificar la acumulación de p-aminoh...

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA GENERAL Y QUIMIOTERAPIA

PRÁCTICA 8 SECRECIÓN TUBULAR ACTIVA DEL ÁCIDO P-AMINOHIPÚRICO EN LAS REBANADAS DE LA CORTEZA DE LA RATA II. OBJETIVO ● Cuantificar la acumulación de p-aminohipurato en rebanadas de la corteza de riñón de rata y determinar cómo dicha acumulación se ve afectada por la presencia de probenecid o por ausencia de energía metabólica. III. FUNDAMENTO QUÍMICO (1 pto.) La identificación y cuantificación de p-aminohipurato se basa en el análisis colorimétrico de aminas aromáticas primarias por diazotación y acoplamiento, específicamente con la reacción de Bratton y Marshall (Connors, 1981). La formación del ion nitrosonio es fundamental para la diazotación, dicha formación del ion se da cuando un mol de ácido clorhídrico reacciona con un mol de nitrito de sodio para forma ácido nitroso, el cual vuelve a reaccionar con otro mol de ácido clorhídrico, generando el ion oxonio, que posteriormente se pierde en forma de agua para finalmente obtener el ion nitrosonio (Figura 1). Las aminas aromáticas primarias, en este caso la amina del ácido p-aminohipúrico, reaccionan con el ion nitrosonio para formar sales de diazonio (diazotación); posteriormente se elimina el exceso del ácido nitroso que no reaccionó con el ácido p-aminohipúrico con sulfamato de amonio. La última reacción que ocurre es el acople de la sal de diazonio con diclorhidrato de N-(1naftil) etilendiamina, generando un compuesto azo colorido (Figura 2).

Figura 1. Formación del ion nitrosonio en la reacción de Bratton y Marshall (Connors, 1981).

Figura 2. Diazotación y acople en la reacción de Bratton y Marshall. La concentración de compuesto azo colorido, el cual es hidrosoluble, se mide mediante espectrofotometría a 540 nm (Connors, 1981).

IV. RESULTADOS (2 ptos.):

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Densidad Óptica (D.O.)

6600tán28a5660 6600tán28a5660

f(x) = 0.04 x + 0.01 R² = 1

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Concentración µM

Figura 3. Curva tipo. La ecuación de la recta y = 0.044x + 0.0066 se utilizó para calcular las concentraciones de PAH en las rebanadas de corteza renal de rata por interpolación.

Ejemplo de cálculo.

3, 4, 5 3, 4, 5

Gráfica 1. Relación t/m para la concentración de PAH en las rebanadas de corteza renal de rata Wistar en condiciones normales (cámaras B y B’), bajo la influencia de un competidor de transportadores (probenecid en la cámara C), de un inhibidor de la cadena respiratoria (2,4-dinitrofenol en la cámara D) y de la ausencia de oxígeno (cámara E). Los resultados se expresan como la media ± EE. ANOVA unifactorial, post hoc de medias Student Newman Keuls. Diferencias estadísticas (P 1.0) mientras que en las cámaras C, D y E sólo hay transporte pasivo (t/m ≈ 1.0) del PAH. V. DISCUSIÓN (5 ptos.): La secreción de p-aminohipurato (PAH) consiste en dos etapas, primero la captura del PAH desde la sangre (en el caso de la práctica desde el medio) hacia las células tubulares renales, en los túbulos proximales, a través de un intercambio con α-cetoglutarato (αKG) intracelular mediado por el

Transportador de Aniones Orgánicos 1 (OAT1) localizado en la membrana basolateral; y segundo, la liberación hacia la luz tubular a través de la membrana apical (Burckhardt y col., 2001). Como la cara interna de la membrana celular está cargada negativamente, la captura del PAH cargado también de forma negativa ocurre en contra de un gradiente electroquímico por lo cual requiere energía metabólica. El OAT1 es un antiportador que favorece el intercambio PAH/αKG en la membrana basolateral. El αKG reingresa a la célula tubular acompañado con 3 iones Na + mediante el simportador NaDC3. El αKG también se puede originar del metabolismo celular o puede ser tomado del lumen por el simportador NaDC1 localizado en la membrana apical. Los iones Na + tomados por NaDC3 o NaDC1 son expulsados de la célula en intercambio con iones K + a través de la Na+-K+-ATPasa. Finalmente, los iones K+ regresan al exterior de la célula a través de canales de K + generando el potencial de membrana predominantemente negativo en la cara interna. En resumen, la captura del PAH hacia la célula ocurre a expensas de ATP por un transporte activo secundario, o terciario propuesto por algunos autores (Burckhardt y col., 2001). Aunque no está del todo dilucidada, la salida del PAH desde la célula tubular renal hacia el lumen puede estar dada por los transportadores NPT1 y MRP2 y es difiere entre especies (Burckhardt y col., 2003). El probenecid es un agente uricosúrico que es filtrado a nivel del glomérulo renal y luego es secretado en el túbulo contorneado proximal para ser reabsorbido a nivel del túbulo contorneado distal. En el riñón, el transportador de aniones URAT-1 reabsorbe al ácido úrico de la orina regresando al plasma y el probenecid interfiere con ese transportador ya que, por ser un ácido orgánico, el probenecid se une al transportador de aniones renal bloqueando el sitio de unión del ácido úrico, previniendo así que retorne al plasma sanguíneo y asegurando su excreción renal, es por ello que el probenecid interfiere con el transporte renal de muchas otras sustancias, entre ellas el p-aminohipurato. (Stocker S. 2008) Los riñones manejan PAH, así como otros muchos aniones orgánicos (p. ej., metabolitos de compuestos endógenos y fármacos administrados) mediante filtración y secreción. El paminohipurato (PAH) administrado se filtra hacia el espacio de Bowman. El PAH se difunde fuera del entramado capilar peritubular y alcanza la superficie basolateral de las células del túbulo proximal. El sistema de transporte de los aniones orgánicos incluye proteínas con estructuras divergentes y amplia especificidad por los sustratos. Estas proteínas pertenecen a varias familias de moléculas acarreadoras, entre las cuales se encuentran las proteínas asociadas a la resistencia de los fármacos (MRP), para el caso del PAH estas proteínas pueden ser OAT1, OAT2, OAT3, OAT4. Estas células tienen una capacidad elevada para secretar PAH desde la sangre hacia la luz tubular en contra de un gradiente electroquímico y a favor de un gradiente de concentración, ya que introducen a la célula compuestos con carga eléctrica negativa y, debe recordarse que, el interior celular es negativo con relación al espacio basolateral. Una vez que ha ingresado a la célula, el compuesto se acumula y sale de manera pasiva por el lado apical, gracias a su gradiente de concentración y a favor de un gradiente eléctrico. El resultado neto de estos dos procesos: entrada basolateral a la célula y salida apical es un transporte vectorial del compuesto, involucrado desde la sangre hasta la luz tubular (Jaramillo, 2019). La nefrona secreta PAH sobre todo en la parte final del túbulo proximal (segmento S3) a través de una ruta transcelular en contra de un gradiente electroquímico considerable, debido a que esta zona posee una gran cantidad de mitocondrias.

El ácido p-amino hipúrico (PAH) se emplea para medir la actividad del transporte activo, ya que debido a su carácter aniónico puede unirse a proteínas acarreadoras y secretarse a través de la secreción tubular activa de aniones (Jaramillo,2008). Este fármaco presenta una gran afinidad a los transportadores presentes en los túbulos proximales, de esta forma pasará hacia los riñones provocando su acumulación en el tejido renal, permitiendo así su cuantificación. El resultado de este transporte se puede observar en la gráfica 1, las cámaras que solo contenían PAH y solución Ringer (B Y B’) obtuvieron una relación t/m de 3 y 2.7 respectivamente, lo cual nos evidencia que se está llevando a cabo transporte activo ya que va en contra del gradiente, además estas cámaras mantienen condiciones de oxigenación, el cual es necesario en el metabolismo energético para la producción de ATP y, por lo tanto, la presencia de transportadores. Las cámaras B y B’ se emplearon como controles positivos. En la cámara C, en las rebanadas de corteza renal tratadas con probenecid y PAH se encontró que la variable t/m es menor (hay una diferencia significativa) en comparación con la magnitud de la variable t/m correspondiente a la cámara B y B´, donde se trató la corteza de rata con PAH. La disminución de esta variable en la cámara C indica que hay una menor acumulación de PAH en la corteza renal; esto debido a que el efecto reportado del fármaco probenecid sobre los transportadores de aniones orgánicos (OAT), que son los encargados de la secreción de fármacos hacia la luz tubular. Se reporta que las acciones del probenecid se limitan en gran medida a la inhibición del transporte de ácidos orgánicos a través de las barreras epiteliales, y la inhibición de la reabsorción de ácido úrico por OAT, principalmente por URAT-1. Sin embargo, el probenecid no es específico para el URAT-1, también inhibe otros transportadores, incluso algunos transportadores de aniones orgánicos (OAT) renales responsables de la secreción de penicilina G y otros de varios fármacos como el metrotexato, el metabolito activo del clofibrato, metabolitos inactivos de glucurónido de AINES tales como naproxeno, ketoprofeno, PAH, indometacina y de este modo no se acumulan en la luz tubular dichos compuestos (Brunton, 2019). En la cámara D, en la cual se adicionó el 2,4-dinitrofenol (DNP) y PAH, con el suministro de oxígeno en la cámara, el DNP se comporta como desacoplante de la fosforilación oxidativa además que produce la pérdida del peso corporal (Roussaux et al, 1986), sin embargo, el efecto que se observó en la práctica fue la disminución en la relación t/m del PAH secretado, ya que los desacopladores de la fosforilación oxidativa disipan el gradiente de protones transportando los protones de regreso a la matriz mitocondrial, sin que pasen por la ATP sintasa. La consecuencia de que los protones no regresen por la ATP sintasa, del espacio intermembrana hacia a la matriz mitocondrial, es que no se lleva a cabo la generación de ATP. Los protones atraviesan la membrana del espacio intermembrana hacia la matriz, a favor de su gradiente electroquímico, por un conducto formado entre las subunidades alfa y beta, provocando un giro de 120° en la subunidad γ, que a su vez produce cambios conformacionales en las subunidades catalíticas. Esta rotación hace girar al tallo central (subunidades γ y ε) en movimientos de 120°, provocando cambios conformacionales consecutivos en las subunidades catalíticas (subunidades α y β) e induciendo la unión de sustratos (ADP + P i), la síntesis de ATP y su liberación (Cano A, 2011), sin embargo el efecto que ocasiona el DNP es la alteración del gradiente electroquímico, por ende la síntesis de ATP es afecta y por consiguiente conlleva a una deficiencia en la cantidad de moléculas energéticas, para llevar a cabo la secreción del PAH, ya que se utiliza un transporte activo. Los desacopladores estimulan la respiración y la producción de calor porque el sistema intenta restaurar el gradiente de protones oxidando más moléculas y bombeando mayor cantidad de protones hacia el espacio intermembrana. Los

desacopladores son típicamente compuestos hidrófobos y ácidos o bases débiles, con un pKa cercano a pH 7. El desacoplador (DNP) está protonado el espacio intermembrana en el cual se encuentra un pH más ácido. Debido a su hidrofobicidad, puede difundirse libremente a través de la membrana mitocondrial interna. Cuando difunde al lado de la matriz mitocondrial, encuentra un pH más básico y se libera el protón (Baynes, 2018), que conlleva a la acumulación los protones en la matriz mitocondrial, afectando claramente en gradiente electroquímico, sin embargo, la difusión del PAH hacia la luz del túbulo renal esta dado por un transporte pasivo, razón por la que se obtuvieron diferencias estadísticas en la relación t/m de la secreción de PAH en la corteza renal. Finalmente, en la cámara E, se encuentra la presencia del PAH, que en condiciones ideales este es secretado por los OAT1 mediante un transporte activo (Burckhardt y cols., 2001), no obstante, en la cámara no hubo un suministro de oxígeno, el cual es de suma importancia, debido que el NADH y el FADH2 transfieren sus electrones de alta energía a la cadena de transporte de electrones, que consta de cuatro complejos principales situados en la membrana interna de la mitocondria. A medida que esta cadena respiratoria transfiere los electrones entre los portadores de electrones, los electrones pierden gradualmente la energía hasta que finalmente se combinan con 2 H + y ½ O2 para formar H2O (Boron, 2016). Considerando que el oxígeno es el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, aunado con la anteriormente mencionado en la cámara D respecto a la ATP sintasa, la ausencia del oxígeno imposibilita la correcta síntesis de ATP y su liberación, que conlleva a una disminución de la energía metabólica, que es empleada en la secreción del PAH hacia la luz del túbulo renal, por consiguiente, la relación de t/m en la corteza de rata es notablemente inferior comparado con las cámaras B y B´ así como diferencias estadísticas significativas. Aunque la cámara A que contenía solamente solución Ringer y no fue graficada, fue de utilidad para corregir el valor de la relación t/m del resto de las cámaras ya que todas contienen una determinada proporción de solución Ringer y es importante despreciar este valor en las lecturas espectrofotométicas para detrminaciones más precisas. VI. CONCLUSIONES (1.5 ptos.):  

La presencia de probenecid y 2,4-dinitrofenol disminuyen la secreción tubular renal activa de PAH. La ausencia de oxígeno merma la secreción tubular renal activa del PAH.

VII. REFERENCIAS ADICIONALES (0.5 ptos.): Mínimo 2 diferentes a las del manual y utilizadas en la discusión. 1. Boron W, Boulpaep L. 2016. Medical Physiology. 3a ed. Elsevier - Health Sciences Division. Filadelfia, PA, Estados Unidos de América. Pp.116-118. 2. Baynes JW, Dominiczak MH. 2018. Medical Biochemistry. 5a ed. Elsevier Health Sciences. Londres, Inglaterra. Pp. 104-106. 3. Brunton, L. 2019. Goodman & Guilman. Las bases farmacológicas de terapéutica. 13a ed. McGraw Hill, México. Pp. 705. 4. Burckhardt, B. & Burckhardt, G. 2003. Transport of organic anions across the basolateral membrane of proximal tubule cells. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 146(1): 95-158

5. Burckhardt, G., Bahn, A. & Wolff, N. 2001. Molecular Physiology of Renal p-Aminohippurate Secretion. News Physiol. Sci. 16(1): 114-118. 6. Cano A, González D. 2011. F1 F0 -atp sintasa y sus diferencias estructurales. medigraphic.com. [Internet]. [citado el 10 de octubre de 2021]. Disponible en: https://www.medigraphic.com/pdfs/revedubio/reb-2011/reb113b.pdf 7. Connors K. 1981. Curso de análisis farmacéutico. Reverté, España. Pp: 246 y 247. 8. Roussaux et al. 1986. Effects of a quatemaiy ammonium saltand2,4-don potato tuber mitochondria. Planl Physiol., 136. 349-355. 9. Jaramillo Juárez F, Cardona Muñoz EG, Rincón Sánchez AR. Farmacología general 3a edición. Aguascalientes, México: UAA-DG;2013...