“ Actividad Enzimática” PDF

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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR FIgueroa Islas Angélica Esperanza, Garay González Mildred Ivette Wendolyn, Hernandez Garcia Elizabeth, León Pérez Martos Aislinn Guadalupe, Teoyotl Martínez Carolina. Bioquímica Experimental, Gpo. 5 , Eq 4. Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Química.

RESUMEN Este experimento se realizó con la finalidad de poder conocer la actividad que tienen las enzimas en presencia de su inhibidor y sin el. La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, estos estudios nos proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad del enzima. La velocidad de una reacción enzimática puede ser medida en el laboratorio. Como la enzima no se consume en el proceso de catálisis de la reacción, se suele medir la disminución de la concentración de sustrato en el tiempo, o el aumento de concentración del producto. Estas concentraciones se pueden medir por espectrofotometría o radiometría. Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad catalítica, ralentizando o paralizando la reacción enzimática, a estas sustancias se las denomina inhibidores enzimáticos. Posterior a su purificación, se trató de determinar la actividad enzimática de la LDH (lactato Deshidrogenasa), manteniendo las condiciones de concentración de la enzima, pH y la temperatura de reacción, se realizó la medición de los parámetros cinéticos, km y Vmax. También se determinó la inhibición que tiene el oxamato en la enzima y de qué manera afecta a la actividad de esta. Para llevar a cabo la determinación de los parámetros cinéticos Vmax y Km se midió la actividad de la enzima en diversas concentraciones de sustrato, y a una sola se le añadió oxamato para poder conocer el comportamiento que tiene la enzima en presencia de su inhibidor. INTRODUCCIÓN Durante el aislamiento y purificación de una enzima es necesario realizar un ensayo para determinar la cantidad y pureza de la misma, así como evaluar sus características cinéticas, es decir la velocidad con la que se lleva a cabo la reacción en distintas condiciones. Las enzimas son proteínas capaces de catalizar específicamente reacciones bioquímicas, la actividad catalítica de las enzimas depende de su estructura, pueden requerir: sólo su secuencia de aminoácidos y su conformación, un cofactor (iones inorgánicos como Fe2+, Mg2+ , Cu2+ ), un grupo prostético (porfirinas), las catálisis enzimática es esencial para sistemas vivos, permite que procesos químicos no favorables energéticamente se lleven a cabo en condiciones biológicas: Medio acuoso, pH neutro, temperatura y presión bajas, cuando la enzima se desnaturaliza, pierde su estructura y por lo tanto su actividad catalítica.

Otra propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad, es decir, solamente catalizan la reacción en la que participa un sustrato determinado (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas características químicas y geométricas comunes (especificidad de grupo). La cinética química es el estudio de la velocidad a la cual una reacción ocurre y de los factores que la alteran. En la cinética enzimática la velocidad, habitualmente denominada actividad enzimática, involucra el seguimiento de la concentración del sustrato o producto que usa o forma, respectivamente la enzima durante un intervalo de tiempo. Las reacciones enzimáticas se dan a una velocidad determinada, algunos factores que determinan esta velocidad son: pH del medio, temperatura, concentración de moléculas de sustrato y la presencia de inhibidores. Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre.

Figura 1. Reacción Enzima-Sustrato y formación del complejo enzima.sustrato.

Inhibidores. La actividad enzimática puede ser disminuida (inhibida) mediante la presencia de sustancias que interactúen con la enzima disminuyendo su capacidad de catalizar la reacción. Inhibición enzimática: moléculas diferentes del sustrato pueden unirse al enzima reduciendo total o parcialmente su actividad catalítica. Estas moléculas reciben el nombre de inhibidores. -Inhibición competitiva: el inhibidor reduce la velocidad de reacción, pero la velocidad máxima (concentraciones de sustrato grandes) sigue siendo la misma. -Inhibición no competitiva: el inhibidor reduce la velocidad máxima pero K m (la afinidad del enzima por el sustrato) sigue siendo el mismo. OBJETIVOS ★ Determinar el efecto del Oxamato (inhibidor) en la LDH, concepto de inhibidor. ★ Conocer el concepto de la ecuación linealizada de Michaelis-Menten y aprender a calcular los parámetros cinéticos. ★ Conocer el concepto de los parámetros cinéticos, Km y Vmáx. ★ Conocer las características generales de las enzimas como catalizadores biológicos. ★ Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un método espectrofotométrico. ★ Relacionar los distintos parámetros asociados a la medición de la actividad enzimática que permiten seguir y evaluar la purificación de una enzima (actividad específica, rendimiento y grado de pureza o enriquecimiento).

HIPÓTESIS Al determinar las constantes cinéticas de la enzima con y sin inhibidor observaremos que la Km de la reacción con inhibidor será mayor que la Km de la enzima sin inhibidor. Se podrá observar el comportamiento de las reacciònes y como es el cambio en su velocidad de reaciòn en funciòn de la cantidad de sustrato y la presencia de un inhibidor.

METODOLOGÍA Y MATERIAL

Figura 1. Diagrama del método que se realizó para medir concentración sustrato y efecto del inhibidor.

Tabla 1.1 Volúmenes añadidos para distintas concentraciones de piruvato en el estudio del efecto de la concentración del sustrato.

Tabla 1.2 Composición de medio de reacción para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato deshidrogenasa.

Material biológico: ● Fracción 3 obtenida en la práctica de purificación. Materiales y equipo: ● 10 Tubos para microfuga ● 1 recipiente para hielo ● 1 vaso de precipitados de 25 mL ● 3 tubos de ensayo 13x100mm ● 1 micropipeta de 1000 microlitros ● 1 micropipeta de 200 microlitros ● 1 micropipeta de 10 microlitros ● 1 micropipeta de 50 microlitros ● Puntas para micropipeta (diferentes tamaños) ● Espectrofotómetro Reactivos: ★ 100 mM amortiguador de fosfatos pH 7.0 ★ 10 mM piruvato de sodio ★ 10 mM oxamato de sodio ★ 4 mM NADH.

RESULTADOS En la tabla 2 y 3 se muestran los datos de pendiente, ordenada al origen,y coeficiente de correlación obtenidos a partir de la regresión lineal de Abs vs. tiempo, de cada una de las muestras de distintas concentraciones de piruvato con y sin el inhibidor oxamato, posteriormente se realizó el cálculo de actividad (Vo) y los dobles recíprocos de las concentraciones y las actividades. Se debe mencionar que se realizaron 6 regresiones lineales para cada efecto estudiado (6 pruebas con distintas concentraciones), pero debido a que algunas de ellas desviaban los resultados se decidieron eliminar, ya que modificaban abruptamente los datos. Tabla 2. Efecto de la concentración sustrato. Concentració n (Mm)

m

b

r^2

actividad

1/C

1/A

0.06

0.0306

0.715

0.976

0.004919614

16.6666667

203.267974

0.15

0.0988

0.8104

0.9948

0.015884244

6.66666667

62.9554656

0.25

0.1068

1.7012

0.9836

0.017170418

4

58.2397004

0.36

0.0891

1.3119

0.9318

0.014324759

2.77777778

69.8092031

Gráfica 1.- Michaelis-Menten para efecto de concentración de sustrato.

(en esta gráfica podemos observar las distintas cantidades de sustrato en función de la actividad o Vo obtenida a partir de la tabla 2, ya que esta no es lineal se procedió a obtener los dobles recíprocos para obtener una gráfica con comportamiento lineal)

Tabla 3.Resultados del efecto del inhibidor Concentración (mM)

m

b

r^2

actividad

1/C

1/A

0.06

0.0172 1.2654

0.9757

0.27368105

16.6666667

3.65388837

0.09

0.0468 1.0779

0.994

0.74466704

11.1111111

1.34288205

0.15

0.0533 0.8323

0.992

0.84809302

6.66666667

1.17911595

0.5

0.0488 0.4258

0.9988

0.77649042

2

1.2878459

Gráfica

2.-Michaelis-Menten

para

el

efecto

del

inhibidor

de

la

actividad.

(en esta gráfica podemos observar las distintas cantidades de sustrato en función de la actividad o Vo, además a esas reacciones les fue añadido el inhibidor oxamato a concentración constante, obtenida a partir de la tabla 3, y ya que esta no es lineal se procedió a obtener los dobles recíprocos para obtener una gráfica con comportamiento lineal) Gráfica 3. Lineweaver-Burk para obtención de linealidad de los datos del estudio del efecto de la concentración.

(en este gráfico se logró obtener una tendencia más lineal, a partir de estos datos nos será posible conocer la Km y Vmáx para esta reacción) Gráfica 4. Lineweaver-Burk para obtención de linealidad de los datos del estudio del efecto deun inhibidor en la actividad enzimática.

(En este gráfico se logró obtener una tendencia más lineal, a partir de estos datos nos será posible conocer la Km y Vmáx para esta reacción) A partir de las regresiones lineales por el método de los dobles recíprocos, se calculó Vmax, como el inverso de la ordenada al origen y Km como el producto de la pendiente por el inverso de la ordenada al origen, la tabla 4 muestra los resultados obtenidos. Tabla 4. regresiones lineales por el método de Lineweaver-Burk para las muestras con y sin inhibidor, resultados de los cálculos de Vmax y Km

Oxamato

m

b

Vmax

Km

0.1552

0.4522

2.21141088

0.34321097

Piruvato

9.2302

36.571

0.02734407

0.25239124

ANÁLISIS DE RESULTADOS DISCUSIONES ➔ Figueroa Islas Angélica Esperanza

Cuando la Km es muy grande significa que la afinidad de la enzima no es mucha y si la Km es pequeña significa que la enzima es afín, Los resultados fueron una Km de 0.3432 para el inhibidor de oxamato y una Km de 0.2523 para el piruvato.La Vmax va directamente unida de la enzima con el oxamato ya que es de 2.2114 o sea mucho mayor que en piruvato que fue de 0,02734, es decir que con oxamato los sitios activos de la enzima estaban saturados por el oxamato (que es competitivo) y no por el piruvato,

➔ Garay González Mildred Ivette Wendolyn

Se midio la absorbancia a diferentes concentraciones de piruvato con y sin inhibidor, en este caso el oxamato, con los resultados obtenidos se tomaron únicamente los que tenían una tendencia más lineal y se descartaron los restantes. La omisión de estos datos es porque las absorbancias aumentaban y disminuian de manera abrupta, esto pudo deberse a un mal preparamiento de los reactivos o a un mal manejo en el espectofotómetro, Para la determinación de los parametros cinéticos se calculo la Vmax que corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental y la Km que es la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax. Obtuvimos una km de 0.34321097 para el oxamato y de 0.25239124 para el piruvato lo cuál indica la mayor afinidad del piruvato a la enzima y menor para el oxamato con la enzima. Para el caso de la vmax que se obtuvo una velocidad máxima de 0.02734407 para el piruvato y 2.21141088 para el oxamato. El oxamato actúa como inhibidor competitivo ya que no modifica su Vmax pero aumenta su Km y debido a que su estructuralmente es muy parecido al piruvato. ➔ Hernandez Garcia Elizabeth

A partir de de las mediciones de absorbancia que presentan las muestras en función y de la cantidad de sustrato añadido, las cuales al graficar en función del tiempo nos permite obtener una pendiente que nos es útil para poder calcular la velocidad de reacción, asì obtener el gráfico de Michaelis-Menten que nos presenta la velocidad en funciòn de la concentraciòn de sustrato, pero ya que este no muestra un comportamiento lineal, se recurre al método de los dobles recíprocos que al realizarlo mostró una tendencia lineal. A partir de estos resultados se pudieron obtener los resultados de Km y Vmax, en cuanto a la comparación de las Km la de mayor tamaño es la de las reacciones con el inhibidor oxamato, esto concuerda con lo esperado. una reaciòn con un inhibidor presentarà una Km de mayor tamaño ya que tiene menor afinidad por la enzima, es decir, al añadir la enzima el inhibidor ocupó los espacios de reacción de la enzima pero al añadir al sustrato este

empieza a desplazar al inhibidor y por eso es posible obtener resultados descendientes en las mediciones de actividad ya que se mide la reaciòn del sustrato con la enzima. ➔ León Pérez Martos Aislinn Guadalupe

Se obtuvo una Km de 0.3432 para el inhibidor de oxamato y una Km de 0.2523 para el piruvato. Esto quiere decirnos que para el oxamato tiene menor afinidad a la enzima por esto da un valor más grande de Km y para el piruvato este tiene una alta afinidad a la enzima por esto el valor de la Km es más pequeño. La velocidad máxima Vmax estima el número de centros activos del enzima, es la velocidad que obtendremos cuando toda la enzima se encuentra unida al sustrato, se obtuvo una Vmax para oxamato de 2.2114 y de 0.0273 para piruvato por lo tanto esto quiere decirnos que el piruvato se encuentra unido por completa a la enzima mientras que el oxalato no se encuentra muy unido a la enzima. Al ver que en el oxamato aumenta la la Km y no se modifica la Vmax podemos determinar que el oxamato es un inhibidor competitivo sobre la LDH debido al gran parecido estructural con el sustrato de la enzima (piruvato). Se tuvieron que omitir las concentraciones de 0.09, 0.5 para piruvato y la concentraciones de 0.25, 0.36 para oxamato ya que estas se disparaban mucho en la regresión lineal y para poder calcular los parámetros cinéticos se tuvo que omitirlas. Estos errores experimentales se pueden deber a que no se agregaron los reactivos correctamente en el piruvato y en el oxamato o a que no se midió correctamente con el espectrofotómetro. ➔ Teoyotl Martínez Carolina.

Una vez tratada de purificar la LDH en las prácticas anteriores se realizó un ensayo de actividad enzimática mediante espectrofotometría, se midió la enzima en diversas concentraciones de sustrato [S] (piruvato), y en presencia de un inhibidor en este caso el oxamato, el cual inhibe a la enzima de interés. Se puede observar que en nuestro gráfico 1 y 2 que la actividad de la enzima depende de la cantidad de sustrato que se le proporcione a una determinada concentración, con base a esto se determinó el cálculo de km y Vmáx por medio del método de dobles recíprocas como se sigue mostrando en el gráfico 1 y 2. Se calculó con base al método Michaelis-Menten para poder evaluar si la enzima obedece a este tipo de cinética tanto como para el efecto del sustrato como del inhibidor, nuestra Km obtenida fue de 0.25239124 y una Vmáx de 0.02734407, para el efecto del inhibidor se obtuvo una Km de 0.34321097 y una Vmáx de 2.21141088. De acuerdo al marco teórico se establece que la Km es la concentración de sustrato a la cual la enzima alcanza la mitad de su velocidad máxima, entre más pequeño sea el valor de Km es mayor la afinidad de la enzima. La velocidad máxima corresponde a cuando todos los centros activos de la enzima se encuentran ocupados. En el cálculo de los gráficos hubo errores debido a que las mediciones obtenidas tenían muy pocos puntos para poder realizar el cálculo de nuestras pendientes. Con lo obtenido podemos decir que los valores de Km aumentan en presencia de un inhibidor, lo que indica que la enzima pierde afinidad por el piruvato, teniendo esto podemos decir que la inhibición del oxamato es competitiva, tomando en cuenta que la estructura tanto del inhibidor como la del sustrato son casi iguales. CONCLUSIONES

➔ Figueroa Islas Angélica Esperanza

Los parámetros cinéticos que medimos en esta práctica, Km y Vmax nos sirven para determinar que tan afín será un sustrato a una enzima y que tipo de interacción/inhibición tendrá, el modelo que nos ayudan a interpretar los datos fue el de Michaelis-Menten junto con la ecuación de Lineweaver para calcular los parámetros ya mencionados y saber que tipo de inhibición es. ● Garay González Mildred Ivette Wendolyn La ecuación de Michaelis-Menten es un modelo matemático mediante el cuál es posible relacionar la velocidad de reacción con concentración de sustrato, al ser graficados obtenemos una hiperbola. Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad catalítica, ralentizando o paralizando la reacción enzimática, a estas sustancias se las denomina inhibidores enzimáticos. En esta práctica observamos el efecto del oxamato como inhibidor competitivo ante el piruvato ya que no modifica su Vmax pero aumenta su Km y debido a que su estructuralmente es muy parecido al piruvato, los inhibidores competitivos afectan el progreso de la reacción al unirse a una enzima, por lo general en el sitio activo, y evitan que el sustrato real se una. ➔ Hernandez Garcia Elizabeth

A partir de un método espectrofotométrico se obtuvo la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa, y se observò el efecto de la cantidad de sustrato y la presencia de un inhibidor en el cambio de la velocidad de reacción para cada muestra preparada, se aprendiò la realizaciòn de las curvas de Michaelis-Menten y los dobles recíprocos para obtener la linealidad de las curvas, asì posteriormente la obtenciòn de Km y Vmax para cada efecto estudiado. ➔ León Pérez Martos Aislinn Guadalupe

El modelo de Michaelis-Menten es una de las aproximaciones más simples y conocidas de la cinética enzimática, que relaciona la velocidad de reacción con la concentración de sustrato que con ayuda de la ecuación de Lineweaver- Burk se pueden determinar de manera precisa la Km y la Vmax. Además de poder analizar el tipo de inhibición en la actividad.  Se obtuvo una Km de 0.3432 para el inhibidor de oxamato y una Km de 0.2523 para el piruvato y se obtuvo una Vmax para oxamato de 2.2114 y de 0.0273. Estos parámetros cinéticos nos ayudan a determinar que tan a fin sera la enzima a su sustrato y también nos ayudan a determinar el tipo de inhibición que se esté presentando en este caso se obtuvo que el oxamato es un inhibidor competitivo.

➔

Teoyotl Martínez Carolina.

Podemos concluir que la ecuación de Michaelis-Menten para las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto. Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la

concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción. Por tanto, la velocida...