Análisis proteómico de la membrana integral lisosómica PDF

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Un análisis proteómico de proteínas de membrana integral lisosómicas revela la composición diversa del orgánulo....

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Un análisis proteómico de proteínas de membrana integral lisosómicas revela la composición diversa del orgánulo. Los lisosomas son organelos subcelulares unidos a la membrana individual que se cree que son los principales compartimentos de degradación en la vía endosomal, albergan una diversidad de hidrolasas que funcionan de manera óptima a pH ácido. La mayoría de las enzimas hidrolíticas residentes se localizan en el compartimento luminal y son glucoproteínas en gran medida solubles capaz de hidrolizar todas las macromoléculas principales de la celda. El papel fundamental de los lisosomas en el metabolismo celular se manifiesta por la ocurrencia de al menos 40 enzimapatogenas que afectan al catabolismo de neutral, fosfo y glicolípidos, complejo carbohidratos y las proteínas donde macromolecular indigeribles intermedios se almacenan dentro del orgánulo, alterando la homeostasis de la célula lo cual conduce a un estado de enfermedad. Más recientemente, se ha descubierto que los lisosomas son altamente dinámicos orgánulos implicados en la secreción regulada, reparación de membrana plasmática dañada y formación de osteoclastos borde con volantes. Los lisosomas han sido implicados en una amplia gama de otras patologías humanas tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedades autoinmunes y resistencia a enfermedades infecciosas, cáncer y drogas. Los roles jugado por los lisosomas en estas áreas siguen siendo poco definidos en gran parte debido a la falta de un conocimiento profundo sobre la composición y topologías de sus proteínas integrales de membrana y la identidad de otras proteínas citosólicas que pueden formar complejos macromoleculares permanentes o transitorios para facilitar las interacciones membrana-membrana y la fusión eventos. Mientras que la caracterización molecular de las enfermedades lisosómicas involucra las enzimas luminales, es decir, solubles, están muy avanzadas, solo unos pocos defectos asociados con proteínas de membrana lisosomal, como la enfermedad de Danon (LAMP-2) 1, Niemann-Pick C (NPC1) (9), cistinosis (cistinosina) y enfermedad de Salla (sialin), han sido identificados. La membrana lisosómica es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis celular, ya que proporciona el enlace de comunicación entre el medio degradativo del lisosoma y el citosol. Aparte del conocido lisosomal de membrana, es decir, los LAMP y los LIMP, pueden ser predichos a partir de la absorción fisiológica y los estudios de flujo que existen múltiples clases de proteínas transportadoras. El objetivo de nuestro presente estudio fue definir la proteína composición de la fracción de membrana integral del lisosoma. Esto se logró mediante la combinación de fraccionamiento subcelular, extracción diferencial y técnicas de separación de proteínas con identificación proteica de tipo proteómico. Uno de los requisitos previos para una investigación exhaustiva de los lisosomas es la capacidad de purificar el orgánulo casi homogeneidad y en rendimiento suficiente. Si bien muchos procedimientos se han utilizado para purificación lisosomal,

elegimos uno de los más confiables y mejor estudiado, a saber, lisosomas de hígado de rata llenos de Tritón WR1339 (tritosomas). A pesar de que los tritosomas se consideran lisosomas modificados ya que contienen una cantidad de material no fisiológico (Tritón WR1339), los tritosomas retienen las actividades enzimáticas lisosomales. En este estudio identificamos 215 proteínas separadas en la fracción de proteína de membrana integral del lisosoma, muchos no asociados previamente con el lisosoma y varios que todavía están identificados como no caracterizados cDNAs. Estos datos revelan una membrana que tiene un complejo composición de proteínas y respaldar la opinión de que lisosoma es un orgánulo altamente dinámico.

Materiales y métodos Aislamiento de lisosomas (tritosomas). El aislamiento de los lisosomas llenos de Triton WR1339 se ha descrito anteriormente. Las ratas (200-300 g de Sprague-Dawley macho de Charles River) recibieron una inyección intraperitoneal del detergente no lítico Tyloxapol (85 mg / 100 g de peso del animal) 5 días antes del sacrificio en una cámara de CO2. Los hígados se eliminaron, se homogeneizaron y se centrifugaron a 1000 rpm. Durante 10 minutos para producir un sobrenadante posnuclear. Se generó un sedimento organellar crudo centrifugando el sobrenadante postnuclear a 34,000 x g durante 10 minutos. El sedimento se resuspendió en sacarosa al 45%, se dispuso en capas debajo de un gradiente discontinuo de sacarosa al 14,3% y sacarosa al 34,5%, y se centrifugó a 77,000 xg durante 2 hrs. Los lisosomas llenos de Triton (tritosomas) se eliminaron de la interfaz 14.3-34.5%, se diluyeron con sacarosa 0,25 M y se sedimentaron a 28,000 xg durante 30 minutos. El fluoruro de fenilmetilsulfonilo (0,1 mM) estaba presente en todas las soluciones.

Microscopio de electrones Las secciones de pellets de tritosomas fijos se procesaron para microscopía electrónica. La fosfatasa ácida se tiñó con la técnica de fosfato de plomo de Gomori.

Subfraccion lisosomal Los tritosomas aislados fueron subfraccionados en base a la solubilidad como se describió anteriormente. Los tritosomas brevemente lavados se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,2 M y se sometieron a cinco ciclos de congelación / descongelación (congelados con hielo seco / etanol y descongelados a 37 ° C). Se recogió una fracción de membrana por centrifugación durante 15 min a 355,000 x g a 4 ° C, y se eliminó el sobrenadante (fracción soluble / luminal). El sedimento de membrana cruda se trató con Na2CO3 0,1 M, pH 11,0 (30 min en hielo) y se centrifugó como anteriormente para dar una fracción soluble asociada a la membrana. El sedimento de membrana restante se designó como fracción de membrana integral.

Fraccionamiento de proteínas de membrana integrales lisosómicas. La fracción de membrana integral se disolvió en guanidina HCl 6M y ditiotreitol 40 mM. La solución se incubó a 45°C durante 30 min para asegurar la reducción completa de los enlaces disulfuro. Se añadió yodo acetamida para dar una concentración final de 150 mM y se incubó durante 1h en la oscuridad a temperatura ambiente. La solución de proteína se dializó luego dos veces durante una noche frente a tampón de columna (ácido fórmico 50 mM, pH 3,6, urea 8 M, eluyente al 1%, Calbiochem).Se realizaron mediciones de conductividad del contenido del saco de diálisis y el dializado para asegurar la eliminación completa de guanidina. La solución de proteína se centrifugó a 10.000 x g durante 15 min a 18°C antes de cargarse en una columna de intercambio catiónico CM-Sepharose preequilibrada en tampón de columna. Las fracciones unidas se recogieron con un gradiente por etapas de NaCl 20, 40, 80 y 250 mM disueltos en tampón de columna. Las fracciones de proteína se precipitaron con acetona, y los gránulos se disolvieron en tampón Laemmli. Las proteínas se separaron mediante electroforesis SDS-poliacrilamida unidimensional estándar en geles de tubo al 12% (5 mm). Los geles (~12 cm) se recuperaron; fijado durante 2 hrs. En metanol al 50%, ácido acético al 10%; colocado en un rebanador de gel; y cortar en rebanadas de 2-4 mm. Las rodajas fueron procesadas para la digestión en gel con tripsina como se describe anteriormente. Los péptidos recuperados se sometieron a separación basada en nano-LC-MS / MS C18 usando un Waters CapLC con una columna PicoFrit C18 (Nuevo Objetivo) en línea con un espectrómetro de masas Q-TOF (Micromass).

Identificación de proteínas Los datos brutos de MS / MS se procesaron en listas de picos (.pkl) utilizando MassLynx Versión 3.5 (Micromass). Los criterios para este procesamiento fueron un umbral de filtro peptídico de 2 y un ancho de pico mínimo a media altura de 2. Las listas de picos se analizaron mediante búsqueda de iones MS / MS (Mascot, www.matrixscience.com) utilizando el Centro Nacional de Biotecnología no -base de datos de proteína redundante (NCBI nr). Algunos espectros se interpretaron adicionalmente mediante secuenciación de novo (Pepseq, Micromass) y etiquetas de secuencia (PeptideSearch, European Molecular Biology Laboratory Bioanalytical Research Group). Todas las proteínas que puntuaron como "hits" significativos de la base de datos por Mascot se verificaron mediante inspección manual de los datos MS / MS. Las proteínas que se identificaron con un único péptido tienen espectros de MS / MS que contienen una serie interpretable de yion adecuada para una búsqueda de etiqueta de secuencia peptídica y tienen puntuaciones de péptido de mascota "identidad" (tabla complementaria 1). Los criterios de búsqueda de la base de datos incluyeron la exactitud de la masa de 0.3 Da y una posible ruptura de la tripsina. En algunos casos, se encontraron modificaciones de oxidación de metionina y péptido de guanidinilación así como Nacetilación del péptido N-terminal a partir de proteínas. Se produjo una lista no redundante de proteínas identificadas mediante la eliminación de duplicaciones mediante el uso de BLASTP para buscar cada proteína frente a una base de datos de todas las proteínas identificadas.

Inmunoblots Se separaron cantidades iguales de proteína (30 μg) de tritosomas purificados y el homogeneizado de hígado de rata originario mediante SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-rata LAMP-1 (ratón monoclonal, Calbiochem), anti-sialiltransferasa 1 (ST6Gal1, amablemente proporcionada por J. Paulson), anti-GPP130 (Covance) y anticalnexina (H-70) y anti -riboforina 1 (C-15, ambos de Santa Cruz Biotechnology). La detección se realizó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante apropiados para la especie con ECL e Hyperfilm (Amersham Biosciences)

Resultados Lisosomas llenos de Tritón WR1339 (tritosomas) -Tritosomas han sido ampliamente caracterizados como secundarios funcionales (etapa tardía) lisosomas. Tenemos previamente demostrado el enriquecimiento de marcadores lisosomales (-hexosaminidasa) actividad, Rab7 y LAMP-1) en nuestras preparaciones (70 veces el enriquecimiento de -hexosaminidasa) y la ausencia de marcadores de las mitocondrias (citrato sintasa) actividad) y ER (proteína calnexina).

Microscopía electrónica de tritosomas aislados •(Fig. 1A) indica que casi todas las estructuras son Tritón WR1339. lisosomas llenos que contienen núcleos densos de electrones y poco o no hay otros organelos Las membranas de estos lisosomas tienen tinción positiva intensa para la actividad de la fosfatasa ácida. •(Fig. 1B) caracterizándolos aún más como lisosomas tritosómicas obtenidas por congelación la lisis del deshielo y la centrifugación revelan una ausencia del electrón núcleos densos y la presencia de membranas amorfas. •(Fig. 1C) Son positivos a la fosfatasa ácida. •(Fig. 1D) Ahí está poco o nada de material de membrana evidente que es negativo para el ácido actividad fosfatasa

La ausencia de organeros contaminantes y la reproducibilidad y confiabilidad del tritosomas preparación junto con la retención de funcional y fisiológico características hace que los lisosomas llenos de Triton WR1339 elección ideal como modelo proteómico. Por consiguiente, después de congelar descongelar la lisis de los tritosomas para eliminar las proteínas solubles, periféricamente las proteínas unidas se eliminaron por tratamiento con carbonato de sodio que da como resultado un sedimento insoluble, es decir, la fracción de membrana integral.

Discusión El enfoque de la proteómica basada en orgánulos permite concentración y por lo tanto la identificación de lo contrario raro en proteínas celulares, mientras que al mismo tiempo ofrece pistas sobre su función in vivo basada en su localización. Dado que los lisosomas son heterogéneos en términos de densidades nativas, son difíciles de purificar por métodos convencionales métodos. Los lisosomas llenos de Triton superan este problema disminuyendo las densidades generales de una gran población de lisosomas en hígado de rata, lo que permite cantidades en miligramos de altamente orgánulos purificados para ser aislados en un solo paso. Las 215 proteínas informadas aquí representan nuestro conocimiento la mayor cantidad de proteínas identificadas a partir de una membrana fracción del lisosoma. Un estudio previo identificó 27 proteínas de una fracción lisosomal soluble que se unía a una columna de afinidad de manosa 6fosfato. Sin embargo, las proteínas de membrana lisosomal generalmente no se transportan al orgánulo a través de esta vía como se refleja por el ciliado de sus oligosacáridos N-ligados. Nuestra combinación de cromatografía de intercambio iónico y SDSPAGE unidimensional seguido de digestión con tripsina en gel y espectrometría de masas (LC-MS/MS) proporciona un alto grado de separación de proteínas. Un hallazgo interesante fue la abundancia relativamente alta de proteínas de la balsa lipídica en la membrana lisosómica. Las balsas de lípidos son pequeños dominios de membrana enriquecidos en colesterol y esfingolípidos que tienen la capacidad de ordenar, concentrarse y organizar proteínas para diversos eventos de señalización celular. Recientemente se ha demostrado que la concentración de proteínas SNARE involucradas en la fusión de vesículas se han encontrado asociados con el retraso membranas endosomal, lisosomal y fagosomal Curiosamente, un aumento coincidente en la cantidad de lípidos balsas en fagosomas con su maduración en fagolisosomas fue demostrado, esto está de acuerdo con nuestro presente hallazgo de una aparente alta abundancia de balsas lipídicas en lisosomas maduros. Su presencia en la membrana lisosómica sugiere importantes funciones de señalización y clasificación incluso este orgánulo de etapa tardía. De acuerdo con esto, hemos identificado el ortólogo de rata de la proteína MEK binding partner 1,

una componente de andamio de la vía endosomal ERK de la cascada de proteína quinasa activada por nitrógeno y que se sabe que se une a p14 (no identificado en este estudio) en el cara citosólica de los endosomal/lisosomas tardíos, un proceso requerido para la activación endosomal de ERK1. Estos hallazgos sugieren una crucial papel de la membrana lisosómica en la comunicación intracelular y eventos de señalización, una función bien descrita de la membrana lisosómica tiene sido el transporte de los productos de degradación a la citosol para su reutilización por la célula. Sin embargo, pocas proteínas vinculadas a estas actividades en el lisosoma han sido identificadas, un notable grupo de proteínas que hemos identificado en este informe son los que se predice que tienen funciones de transporte, p. Dominios EMP70, o aquellos en la familia de portadores de soluto. Estas proteínas ahora se puede evaluar la función de transporte molecular con respecto a la membrana lisosomal y su contenido luminar aunque la biogénesis de novo de los lisosomas no se conoce bien, la identificación de proteínas entre los lisosomas y sus organelos relacionados pueden ayudar a dilucidar cómo ellos son formados. Otra pista para comenzar a entender los procesos de biogénesis lisosómica y mantenimiento surge de nuestro hallazgo de la llamada proteína "gris-letal" (Gl). Gl Está claro que la composición proteica de la membrana lisosómica está influenciada por contribuciones de Golgi, ER y componentes de la membrana plasmática. Resaltando que fue la identificación en la integral fracción de membrana de las transferasas de Golgi, p. sialiltransferasa 1, y otras glicosiltransferasas, algunas de las cuales tienen se ha demostrado que tiene localizaciones posteriores al Golgi, además, se encontraron algunas proteínas ER abundantes, p. proteína disulfuro isomerasa, riboforina 1 y citocromo P450s. A través de nuestra estrategia proteómica lisosómica, parece claro que la membrana es una estructura muy diversa que recibe membrana y las contribuciones de proteínas de una variedad de subcelular fuentes y caminos a través del tráfico vesicular e intracelular dinámica de la membrana, el alto grado de diversidad de las proteínas de la membrana lisosómica es indicativo de un organelo altamente complejo....