Analytische Chemie Boek SV PDF

Preview

Summary

Analytische Chemie (boek) Hoofdstuk 3 Fundamental Chemical Properties, Buffers and pH pH log ( ) pKa log (Ka) Ka is de evenwichtsconstante (rechts : links) Als de ratio 9:1 is base) dan daalt de pH met 1. Als de ratio 99:1 is base) dan daalt de pH met 2. De distributieconstante (KD) is afhankelijk v...

Description

Analytische Chemie (boek) Hoofdstuk 3

Fundamental Chemical Properties, Buffers and pH

pH = – log ( [H+] ) pKa = – log (Ka)

Ka is de evenwichtsconstante (rechts : links)

➢ Als de HA/A- ratio 9:1 is (10% = base) dan daalt de pH met 1. Als de ratio 99:1 is (1% = base) dan daalt de pH met 2. De distributieconstante (KD) is afhankelijk van twee variabelen: de temperatuur en de aard van de twee fasen. KD = [A]org / [A]aq Wanneer een deeltje geladen is, heeft het een sterke affiniteit voor de waterlaag, aangezien de ionen hier worden vastgehouden door de watermoleculen. Slechts ongeladen deeltjes kunnen migreren tussen de verschillende lagen. Daarom moet extractie plaatsvinden bij een hoge pH voor basen en bij een lage pH voor zuren. Dan zijn alle deeltjes neutraal/ongeladen. ➢ Log P is de verdeling van analiet tussen octanol en water. Bij verschillende pH waardes wordt dit Log D genoemd. Hoofdstuk 4

Fundamentals of Pharmaceutical Analysis

De standaard deviatie kun je berekenen door eerst het gemiddelde te berekenen van al je metingen. Vervolgens trek je van de waardes het gemiddelde af en doe je dit in het kwadraat (hier de som van). Dit deel je dan door het aantal metingen – 1 en uiteindelijk neem je hier de wortel van (Boek blz 53 goed voorbeeld).

(N = aantal metingen – 1) Hoofdstuk 7

UV Spectrophotometry

Bij absorptie wordt een elektron naar een orbitaal met een hoger energielevel geëxciteerd. Er moeten oplosmiddelen gebruikt worden die zelf niet “meedoen” aan de absorptie van het UV licht. De oplosmiddelen hebben per stuk een bepaalde “cut-off”. Dit is de golflengte waarbij ze zelf niks van het UV licht absorberen en dus alles doorlaten. Boven deze cut-off absorberen ze wél. Bij UV spectrofotometrie moet het absorptiemaximum van de analiet ingesteld worden (die golflengte dus). Hierbij zou je dan een optimale lineaire kalibratiecurve (absorbtie als functie van de concentratie) moeten krijgen. In dit geval is de curve erg steil en de gevoeligheid (sensitivity) is gelijk aan de helling van de curve.

Hoofdstuk 10 Chromatography Bij chromatografie heb je altijd een mobiele en stationaire fase. De samenstelling van de mobiele fase, de samenstelling van de stationaire fase en de temperatuur beïnvloeden de retentietijden van de analieten. De retentietijd (tR) is de tijd van injectie tot maximale detectierespons. De retentietijd wordt beïnvloed door de snelheid van de mobiele fase (Flow) en door de kolomlengte (hoe kleiner, hoe minder scheiding). •

KC =

•

k

𝐶𝑠

= Equilibrium Distribution Coefficient (verdeling mobiele en stationaire fase)

𝐶𝑚

= hoeveelheid stof in stationaire fase / hoeveelheid stof in mobiele fase

➢ LET OP! K gaat dus over de concentratie en k over de hoeveelheid. De verdeling van analiet hangt dus af van KC en van de volumes van de stationaire en mobiele fase. Wanneer de retentiefactor k 1 is, geldt dat er evenveel analiet in de stationaire als in de mobiele fase zit. Wanneer de retentiefactor k 5 is, geldt dat er 5x meer analiet in de stationaire fase zit. •

k=

𝑡𝑅−𝑡𝑀 𝑡𝑀

tR – tM = de tijd dat de stof in de stationaire fase zit tM = de tijd dat de stof in de mobiele fase zit

VM = Void Volume (Hold-up volume bij hold-up time tM). •

VR = tR x F

•

VM = tM x F

F = Flow rate van de mobiele fase door de kolom

Piekverbreding door de kolom heen wordt uitgedrukt door het schotelgetal N (= plate number) ▪

𝑡𝑅

N = 16 x ( )2 𝑊

W = piekbreedte (schatten bij baseline)

➢ Hoe groter N, hoe efficiënter de kolom scheidt (en dus smalle pieken geeft *aan het begin). Wanneer de retentietijd toeneemt, worden pieken automatisch breder. ▪

N=

𝐿

L = kolomlengte in mm H = Schotelhoogte in mm

𝐻

Scheidingsfactor α =

(langere kolom = grotere N = betere scheiding) (hoe kleiner hoe efficiënter)

𝑘2 𝑘1

= mate voor de Selectiviteit. Selectiviteit neemt toe als de pieken verder uit elkaar staan (dan is k2 dus groter/verder). α is groter dan 1 of gelijk aan 1. De mate van scheiding wordt bepaald door de Resolutie Rs =

2(𝑡𝑅2−𝑡𝑅1) 𝑤1+𝑤2

Wanneer Rs = 1.5 is er volledige scheiding.

Deze formule geldt ook voor de resolutie. Optimale resolutie vindt plaats als k tussen 3 – 10 zit. Wanneer a toeneemt (scheiding) zal Rs ook toenemen.

High selectivity = genoeg afstand High efficiency = smalle pieken Poor selectivity = weinig afstand Poor efficiency = brede pieken

Hoofdstuk 11 Chromatographic Separation Principles Bij Gaschromatografie (GC) vindt er weinig interactie plaats tussen analiet en mobiele fase (inert draaggas). Vertraging en scheiding wordt dus beïnvloed door de stationaire fase. Bij Vloeistofchromatografie (LC) vindt er interactie plaats van analiet met andere moleculen in de mobiele fase én in de stationaire fase. Hierdoor zijn er meer parameters die invloed hebben op de scheiding. ▪

Normal Phase (polaire stationaire fase) :

Silica is de meest gebruikte stationaire fase en is te vergelijken met een spons. Het heeft allemaal Silanolgroepen (-Si-OH) aan het oppervlak. Ze maken het oppervlak polair en ze gedragen zich als zwakke zuren. Sommige silanolgroepen kunnen H-bruggen vormen met aangrenzende silanolgroepen (deze zullen dan minder actief zijn bij het absorptieproces dan de geisoleerde silanolgroepen). Om te voorkomen dat er te sterke binding plaatsvindt in de stationaire fase wordt er vaak water of zuur toegevoegd aan de mobiele fase (zuur omdat er dan competitie ontstaat voor de analiet met de stationaire fase en de mobiele fase → de stationaire fase is namelijk ook een (zwak) zuur). Wanneer de interactie tussen analiet & stationaire fase namelijk te sterk is, zal tailing ontstaan. 4 soorten polaire interacties met de stationaire fase (zwak naar sterk): 1. Van der waals bindingen (elektrostatische interactie) 2. Dipool-dipool interactie 3. Waterstofbruggen 4. Ion bindingen Het aantal polaire groepen bepaalt de polariteit (een molecuul met 2 OH-groepen is polairder dan een molecuul met 1 OH-groep). De mobiele fase is bij Normal Phase apolair (gemaakt van organische oplosmiddelen). Wanneer een mobiele fase sterke bindingen (van analiet met de stationaire fase) tegengaat heet het een Sterke mobiele fase. Wanneer het alleen de zwakke bindingen tegengaat is het een Zwakke mobiele fase. Of het een sterke of zwakke mobiele fase (= oplosmiddel) is hangt af van de polariteit (hoe polairder, hoe sterker en hoe korter de retentie). ▪

Reversed Phase

De stationaire fase is in dit geval hydrofoob (apolair). Er zijn dan hydrofobe groepen gebonden aan de silanolgroepen. Vaak wordt Octadecyl (C18) gebruikt voor de stationaire fase.

Stationaire fases met silica kunnen gebruikt worden bij een mobiele fase met pH 2-8 (buiten dit interval lost het op in het te zure/basische milieu). Bij Reversed Phase vinden er vooral Van der Waals interacties plaats (zijn eigenlijk zwak, maar er zijn er veel per molecuul). Hoe groter het molecuul, hoe meer VdW verbindingen, hoe sterker de interactie. Over het algemeen worden de Silanolgroepen (die polaire bindingen aangaan) gemaskeerd door hydrofobe groepen zodat Reversed Phase Chromatography kan plaatsvinden, maar soms worden niet alle Silanolgroepen gemaskeerd, waardoor er een klein aantal polaire bindingen kunnen plaatsvinden. Dit zorgt dan ook voor retentie. Retentie vermindert bij toenemende ionisatie, dus wanneer er zoveel mogelijk stof neutraal is wordt de vertraging groter. Wanneer deeltjes volledig geioniseerd zijn of wanneer ionisatie volledig onderdrukt is, heeft een kleine verandering in pH geen invloed op de retentie. Omdat veel silica-gebaseerde kolommaterialen niet tegen een pH hoger dan 8 kunnen, wordt er vaak gewerkt met zuren die in neutrale toestand verkeren en met basen die in geioniseerde toestand verkeren. De retentie bij neutrale compounds is niet afhankelijk van de pH. Retentie van ionische compounds neemt toe wanneer ionisatie daalt. ▪

Ion Exchange Chromatography

Analieten worden vertraagd door ionische interactie met tegenovergestelde lading bij de stationaire fase. Positieve kationen hebben affiniteit voor de negatief geladen “exchangers”. Deze exchangers worden daarom Cation Exchangers genoemd. Anion Exchangers zijn dan positieve exchangers die de negatieve anionen aantrekken. SCX = Strong Cation Exchanger (deze is dus erg negatief en trekt positieve kationen aan). SAX = Strong Anion Exchanger (deze is dus erg positief en trekt negatieve anionen aan). *Wanneer ze zwak zijn wordt de S vervangen door W (weak) → WCX of WAX. Sterke ion Exchangers zijn over de hele pH range geladen en Weak ion Exchangers zijn maar bij een deel van de pH range geladen (afhankelijk van de functionele groep en zijn pKa). Analieten moeten dus ook geladen zijn, wil je vertraging krijgen. Ook geldt dat kleinere analyten makkelijker interactie aangaan en dus meer worden vertraagd. Vertraging kan veranderd worden door organisch oplosmiddel toe te voegen aan de mobiele fase of door de buffer concentratie te veranderen. Wanneer er meer buffer is, zal er meer competitie zijn tussen de buffer en het analiet (want ze willen dan beiden op de ionische stationaire fase zitten). De stationaire fase zal dus ook door buffer bezet worden waardoor analieten minder interactie hebben en dus een kleinere vertraging.

Hoofdstuk 12 Thin-Layer Chromatography TLC is nauwkeuriger, aangezien alle stoffen zichtbaar worden, dus ook de stoffen die een zeer sterke interactie aangaan met de stationaire fase (en die dus het minst mee naar boven genomen worden door de mobiele fase). Bij andere scheidingsmethoden worden die stoffen (die

dus een erg sterke interactie aangaan) pas zeer laat gedetecteerd, waardoor dus ook erg laat pas de piek verschijnt die vaak ook erg breed is. De retentiefactor kan als volgt berekend worden: x = de afstand van de stip y = de afstand van de mobiele fase

Rf kan tussen 0 en 1 zitten. Hoe dichter bij 0, hoe sterker de interactie met de stationaire fase.

Hoe kleiner de deeltjes in het TLC plaatje, hoe beter de scheiding (Van Deemter). De mobiele fase moet vluchtig zijn en zal verdampen na de chromatografie. Vertraging wordt veroorzaakt door de aard van de analieten en door de “Solvent strength” van de mobiele fase. Lage solvent strenght zorgt voor grote vertraging (kleine Rf) en andersom. Hoofdstuk 13 -

High Performance Liquid Chromatography

Van Deemter vergelijking

B

H = A + + Cu u

o

H = Efficiëntie (= de hoogte van de theorethische schotel)

o

U = Flow rate

o

A, B, C = Band Broadening Phenomena (bandverbreding)

(ml/min)

A : Eddy Diffusion Dezelfde moleculen leggen andere routes af door de stationaire fase dankzij de ongelijkmatige packing hiervan. Het effect van A op H is onafhankelijk van de flow rate. B : Longitudinal Diffusion Diffusie van het molecuul (Brownian movements) in de mobiele fase. Moleculen die opgelost zijn in vloeistof diffunderen naar plekken met lagere concentraties. Radiale diffusie (in de breedte) heeft geen invloed op H. Longitudinale diffusie (over de kolomlengte) zorgt wèl voor bandverbreding, vooral bij een lage flow rate (u). B is van groter belang bij GC dan bij LC, vanwege hogere diffusie bij hogere temperatuur. C : Mass Transfer Het transport dat heen en weer gaat tussen de mobiele en stationaire fase. Bandverbreding ontstaat wanneer moleculen deels in de stationaire fase ‘vastzitten’ terwijl sommige moleculen meegenomen worden door de mobiele fase. Wanneer de deeltjes kleiner zijn in de stationaire fase, zal de schotelhoogte afnemen. Hierdoor is er ruimte voor meer schotels in de kolom (N hoger = schotelgetal) waardoor de efficiëntie toeneemt. Het minimum van H is dus het optimum van de efficiëntie.

De kolom moet een hoog schotelgetal N hebben voor goede scheiding. Dit is mogelijk als de schotelhoogte H dus klein is. Wanneer er kleinere deeltjes gebruikt worden kan ook de kolomlengte verkleind worden, mits de flow rate omhoog gaat. Dan is er nog steeds sprake van goede scheiding, maar nu hoeft er niet zoveel mobiele fase gebruikt te worden. Analieten die de ingestelde golflengte absorberen, kunnen worden gedetecteerd. Hiervoor moet het analiet minstens een dubbele band hebben die de chromofoor is (=kleurdrager). ➢ Injector Wanneer de injector op de Load stand staat, gaat de mobiele fase door de valve in de kolom. Wanneer de injector op de Inject stand staat, gaat de mobiele fase door de Loop naar de kolom en neemt het geinjecteerde sample mee. ➢ Mobiele fase De mobiele fase bij Reversed Phase LC bevat vaak waterige bufferoplossingen. Dit is vaak gemengd met een organic modifier. Voordat de mobiele fase gebruikt wordt, moet hij worden ontdaan van gassen (door ultrasound treatment / purgen met helium / vacuum treatment). Er mag namelijk geen gas bij de detector komen aangezien er dan bubbels kunnen ontstaan daar die “noise” bij het detectorsignaal veroorzaken. UV response neemt toe met dalende golflengte. ➢ Sample oplossing Je sample los je op in een deel van je mobiele fase. De oplossing van je sample mag namelijk geen grotere solvent strength hebben dan de mobiele fase. Ook moet 100% methanol als mobiele fase vermeden worden, want dan vindt er geen interactie plaats en krijg je brede pieken. Wanneer grotere samplevolumes geinjecteerd moeten worden is het handig om een lagere solvent strength te hebben bij je sample dan in de mobiele fase. ➢ Isocratic elution = de mobiele fase heeft dezelfde samenstelling. ➢ Gradient elution = de mobiele fase heeft een stijgende solvent strength. Hoofdstuk 14 Gas Chromatography GC wordt over het algemeen gebruikt om vluchtige onzuiverheden te detecteren. De kolom wordt verhit en de mobiele fase is een dragergas. Sample wordt in een verhitte injector geinjecteerd waar alles verdampt. Alleen vluchtige deeltjes kunnen gescheiden worden met GC. De vluchtigheid hangt af van temperatuur. Deze moet niet té hoog zijn, anders ontleden de stoffen.

Het draaggas wordt ook verhit en gaat door temperatuur-gecontroleerde “Flow Controllers” naar de injector. Het gaat ook door een reduction valve die de druk sterk laat afnemen. Minder sample hoeft geinjecteerd te worden (0.5-2 microliter). De stationaire fase is een vloeistof of een gas. De detector heeft een hogere temperatuur dan de kolom in de oven, om zo condensering van stoffen in de detector te voorkomen, nadat deze uit de kolom komen. Vertraging wordt verminderd door hogere kolomtemperaturen, aangezien de dampdruk dan stijgt en de distributie naar de mobiele fase gaat. Parameters die GC bepalen: -

Temperatuur van de injector, kolom en detector

-

Type en hoeveelheid stationaire fase (oplosbaarheid van analiet hierin)

-

Kolom dimensie (afmetingen)

-

Type draaggas en zijn snelheid

Belangrijkste parameter die de scheiding bepaalt = kolomtemperatuur Vuistregel: De retentietijd halveert als de kolomtemperatuur stijgt met 30 graden. De kolomtemperatuur is lager dan het kookpunt van de stoffen. De injectietemperatuur is hoger dan die van de kolom/oven, zodat oplossingen snel verdampen. Wanneer de injectietemperatuur te laag is, duurt het langer om de analieten in gasfase te brengen → bredere pieken en slechte scheiding. Te hoge temperatuur kon dus leiden tot ontleding. Wanneer een sample stoffen bevat die ongeveer hetzelfde kookpunt hebben, kan isothermal GC analysis gebruikt worden (constante kolomtemperatuur). Wanneer deze methode wordt gebruikt bij stoffen met zeer verschillende kookpunten zullen er brede pieken en lange retentietijden optreden. Daarom kan ook temperature programming gebruikt worden, waardoor de temperatuur tijdens de analyse stijgt. Wanneer de snelheid van het draaggas erg langzaam/snel is zullen de pieken verbreden. HETP = Height equivalent to a theoretical plate (in mm). Het optimum van H2 ligt bij een veel hogere flow rate dan die van N2, wat dus betekent dat de scheiding m.b.v. H2 veel sneller plaatsvindt (de analysetijd bij H2 is gehalveerd in vergelijking met die bij N2). Wanneer er een flow rate boven het optimum gebruikt wordt, zal de scheidings efficiëntie afnemen (plot wordt steiler). Bij N2 stijgt de lijn erg snel (na optimum). Dit komt omdat N2 erg groot is en daardoor belemmert het mass transfer → bredere pieken. Helium is de veiligste optie. Column Bleeding = verlies van stationaire fase door een te hoge temperatuur (waardoor de stationaire fase dus niet intact blijft). Wanneer een te lage temperatuur gebruikt wordt, zal de stationaire fase te kleverig zijn, waardoor er minder interactie is met analiet → bredere pieken. Bij apolaire stationaire fases worden analieten gescheiden op basis van hun kookpunten. Dit komt omdat er bij een apolaire stationaire fase bijna geen interactie plaatsvindt (en naarmate de stat fase

polairder wordt, vindt er wél interactie plaats met analiet). Analieten met lage kookpunten worden geëlueerd vóór analieten met hogere kookpunten. Vertraging hangt dus af van kookpunt en oplosbaarheid in stationaire fase. Bij GC worden vaak Capillary Columns gebruikt (er zijn ook packed columns). Fused silica capillairen worden het liefts gebruikt vanwege hun inactiviteit. Ze zijn hetzelfde als de kolom bij CE, maar nu zijn de afmetingen anders. Hoe meer stationaire fase, hoe groter de vertraging (betere scheiding). Het Capillair is een open buis en er is slechts een kleine drukverlaging bij de kolom als het draaggas erdoorheen gaat. Hierdoor kunnen lange kolommen gebruikt worden, zonder dat de druk te hoog wordt. Bij capillaire kolommen is er minder stationaire fase aangezien de kolom smaller is dan een packed column. Omdat de kolom zo smal is, is het risico op “Overloading” (→ bredere pieken) groot, dus hier wordt rekening mee gehouden bij het injectiesysteem: overtollig sample wordt afgevoerd. Manier van injecteren: Sample wordt met een injectiespuit door een septum in de injector gespoten, waar het direct verdampt in de glazen buis. Dankzij de Split Purge, kan overtollig sample ontsnappen. De Septum purge zorgt ervoor dat er geen onzuiverheden de kolom in gaan.

Het risico bij GC is dat analieten kunnen ontleden door de hoge temperatuur of ze kunnen condenseren in de injector Vuistregel: Het schotelgetal (N) van een capillaire kolom is 3000 per meter. Daarom is GC een van de beste scheidingsmethodes. ➢ Detector o

Flame Ionization Detector (FID) Analieten worden bij de vlam geioniseerd → ionen gevormd in de detectorkamer. 2 elektrodes meten de spanning en zo ook hoeveel ionen er zijn. Bij de ingang van de detector wordt het draaggas met waterstof gemengd. Dit gaat naar binnen via een “Jet” waarboven de vlam brandt. De ionen en elektronen worden (bij 300V) gemeten bij de collecting electrode boven de vlam. De stroom die gemeten wordt is gelijk aan de hoeveelheid verbrande organische stof (analiet).

o

Nitrogen-Phosphorus Detector (NPD) Zorgt voor selectieve detectie van stoffen met stikstof en fosfor. Ook wel Alkali Flame Ionization Detector (AFID) / Thermionic Detector (TID) genoemd. Zelfde bouw als FID maar dan met een kristal van alkalimetaalzout boven de vlam. Stikstof- en fosforbevattende stoffen reageren hiermee.

Hoofdstuk 15 Capillary Electrophoresis Positieve ionen (kationen) → katode (negatieve elektrode) Negatieve ionen (anionen) → anode (positieve elektrode) ➢ Snelheid van een ion in het systeem =

v = μe x E

V = ionsnelheid μe = elektroforetische mobiliteit E = elektrisch veld ➢ μe =

𝑧 6𝜋𝑟n

z = lading van het ion r = ionstraal η = viscositeit van het oplosmiddel (kleverigheid) Hoe groter de lading, hoe groter de mobiliteit. Hoe g...